Visualisatie en analyse van mRNA moleculen met behulp van fluorescentie<em> In Situ</em> Hybridisatie in<em> Saccharomyces cerevisiae</em

Figuren 1 en 2 zijn schema's van de FISH experimentele procedures en beeldanalyse pijpleiding voor FISH kwantificering afbeeldingen. 1. Oplossingen voor te bereiden * Onderstaande oplossingen zijn voor gebruik met Singer sondes. Bij gebruik Stellaris sondes, vervang "40% formamide" met "10% formamide" in zowel Hybridisatiebuffer en Wash Buffer. Aanvullende wijzigingen aan Hybridisatiebuffer bij het gebruik Stellaris sondes zijn (1) voeg 1 g dextransulfaat en (2) zijn exclusief 10 mg ssDNA. Buffer B 8 ml 1 M KH 2 PO 4 41,5 ml 1M K 2 HPO 4 109,3 g Sorbitol Spheroplasting Buffer 890 ul buffer B 100 gl VRC 10 ul 25.000 U / ml Lyticase 2 pl β-mercaptoethanol <strong> hybridisatiebuffer (10 ml, eindvolume) 10 mg E. coli tRNA 10 mg ssDNA * 100 ul 200 mM VRC voorraad 40 ui van 50 mg / ml BSA 1 ml 20X SSC 4 ml 40% formamide * Nuclease Free Water (tot 10 ml eindvolume) 1 g Dextran Sulfate * * Hybridization Buffer kan in 0,5 ml aliquots gemakshalve worden bewaard bij -20 ° C. Wash Buffer (50 ml, eindvolume) 5 ml 20X SSC 20 ml 40% formamide * Nuclease Free Water (tot 50 ml eindvolume) Labeling Buffer 1.06 g Natrium Carbonaat 100 ml DEPC Water pH 9 2. Probe-labeling (Singer Probes Only) We krijgen deze probes door in-house-synthese met behulp van een ABI oligonucleotidesynthese apparaat. Typically worden 4-5 ~ 50 bp gesynthetiseerde oligonucleotiden die homoloog zijn aan het gen van belang, vervangende amino-allyl thymidine meerdere thymidinen afstand ten minste 8, bij voorkeur 10 bp + elkaar. Vanwege hun gevoeligheid voor ozon, werken we in een ozon-free voorziening bij het gebruik van CY kleurstoffen. Verkrijgen ~ 5 sondes en resuspendeer in 100 pl water – check concentraties op Nanodrop. Afhankelijk van het aantal probes / gen gecombineerd totaal van 10 ug oligonucleotiden / gen (bijvoorbeeld als probes zijn 5 / gen, dan wil 2 ug / probe). Gebruik QIAquick kolommen probes zuiveren volgens QIAquick Nucleotide Removal Kit Protocol. Voeg 10 volumes buffer PN het volume van gecombineerde probes en meng totaal. Toepassing monster te QIAquick column – als totale volume groter is dan 750 ul, spin down tweemaal met de helft van het volume in elke spin Laat staan ​​voor 1 min. Centrifugeer 1 min bij 6000 rpm. Wassen met 750 ul buffer PE. Centrifuge1 min bij 6000 rpm. Gooi doorstroming en opnieuw spinkolom gedurende 1 min bij 13.000 rpm te drogen. Column plaats QIAquick in nieuwe microcentrifugebuis en elueer DNA met 50 ul H 2 O – Zorg dat H 2 O pH is binnen 7.0 en 8.5 en is direct geplaatst op membraan. Laat staan ​​voor 1 min. Centrifugeer gedurende 1 min bij 13.000 rpm om DNA te elueren. Lyofiliseren DNA bij 45 ° C. Resuspendeer pellet in 10 ul etikettering buffer en voeg aan buis van kleurstof zonder het aanraken van de kleurstof. Herhalen met een andere 10 pl labeling buffer. Vortex en spin down tube kleurstof en DNA. Bedek buizen met aluminiumfolie en in het donker bewaren bij RT O / N te labelen. Herhaal QIAquick Nucleotide Removal Kit Protocol. Voeren met twee verschillen: – Voeg 200 ul PN buffer om sondes en zet gelabelde probes door kolommen 2x. – Voer 3 wassingen met buffer PE om weg te wassen alle losse kleurstof voor elutie. After elutie verkrijgen concentratie via nanodrop. De etikettering efficiëntie is meestal ~ 0.25 pmol / ng enkelstrengs DNA. 3. Dekglaasje Voorbereiding Plaats dekglaasjes op dia's in plasma-preen vacuümkamer ( http://www.plasmapreen.com/ ) (hoe dichter bij het ​​centrum hoe beter). Zet vacuümkamer magnetron en zorg ervoor dat het is verzegeld. Schakel de pomp eerst zet vacuüm slechts eenmaal pomp wordt gestart. Zet magnetron en stop 5 seconden na plasma zichtbaar. Schakel vacuüm dan pomp. Trek vacuümkamer en dekglaasjes te verwijderen met een pincet (degenen die zijn gevallen opnieuw moeten worden gereinigd). Plaats dekglaasjes schoongemaakt kant op in 12-well platen. 4. Fixatie Procedure Groeien gist om een OD 600 van ongeveer 0,1-0,2 in minimale media. 10 ml cellen levert voldoende for ~ 10 aparte kruisingen. Voeg 1/10 volume 37% formaldehyde rechtstreeks aan de groei media (10 ml van de cultuur + 1 ml 37% formaldehyde) en laat zitten voor 45 minuten. 2x wassen met 1 ml ijskoude buffer B in een microcentrifugebuis (kan draaien bij 13.000 rpm gedurende 1 minuut). Voeg 1 ml van spheroplasting buffer. Incubeer bij 37 ° C gedurende 15 minuten. Controleer cellen elke paar minuten onder de microscoop tot de meeste cellen zijn zwart (dus niet fase-fel). Wassen 2x met ijskoude buffer B, spinnen bij een lage snelheid (~ 3500 rpm). Voeg 1 ml 70% EtOH, resuspendeer zacht en laat overnacht bij 4 ° C (kan oneindig bewaard bij -20 ° C). 5. Hybridisatie Procedure Bereid de hybridisatieoplossing: 100 gl hybridisatiebuffer, voeg 1-3 ui sonde, dan vortex en centrifuge. Zanger sondes gebruiken 8-10 ng totaal per probe set (dwz per gen). We hebben gelijktijdig belicht tot 3 genen met 3 diflende gemerkte probe sets. Zorg ervoor dat de hybridisatie-oplossing op kamertemperatuur komen alvorens het te openen. Voor Stellaris sondes wordt aanbevolen om 4 aparte hybridisatiereacties beginnen met het toevoegen van 1 pl elk van 1:10, 1:20, 1:50 en 1:100 werkverdunningen van probes om te zien welke optimaal is. Werkverdunningen van Stellaris probes worden bereid in hybridisatie buffer. Centrifuge (voor alle volgende stappen, 3500 rpm, 5 min) van de vaste cellen (bv. 200 pl) en zuig weg van de ethanol. Voorzichtig hersuspenderen in 1 ml wasbuffer die hetzelfde percentage formamide de hybridisatie buffer bevat. Laat staan ​​voor 2-5 minuten. Centrifugeer monster en aspireren wasbuffer, voeg dan hybridisatie-oplossing. Incubeer in het donker met zacht schudden, O / N bij 37 ° C. Opmerking: de volgende procedure is voor het aanbrengen / beeldvorming cellen op dekglaasjes. Voor wverassen / beeldvorming cellen in 96-well platen, waaronder alternatieve reactieve zuurstofradicalen scavenger oplossing zien http://www.biosearchtech.com/stellarisprotocols. De volgende dag, of vooraf schoon (zie werkwijze) en behandel dekglaasjes met 150 ul 0.01% Poly-L-Lysine gedurende 5 minuten. Aspireren, laten drogen, wassen 3x met dH 2 O en laat drogen. In de ochtend, voeg 1 ml wasbuffer aan het monster voorzichtig resuspenderen, centrifuge en zuig vervolgens hersuspenderen in een 1 ml wasbuffer en incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten. Wassen met 2X SSC + 0,1% Triton X-100 bij kamertemperatuur 15 min te shaker. Neem montage medium uit vriezer om deze te komen tot kamertemperatuur voor de montage. Wassen met 1X SSC bij RT 15 min. op shaker. Verdun DAPI in PBS (0,1 ug / ml eind) en resuspendeer cellen in 150 pi. Plaats oplossing op gereinigd / poly-lys-Treated dekglaasjes in 12-well plaat; minstens 30 minuten ongestoord. Verwijder oplossing (u kunt het op een reserve dekglas als back-up) en was 3x met 1 ml 1X PBS. Plaats 3 pi Verleng Gold montage medium op een dia (Invitrogen P36934). Doe dit een voor een als u meerdere dekglaasjes te voorkomen dat ze uitdrogen van montage medium. Voeg ~ 0,5 ml ethanol te dekglaasje in 12-well plaat, verwijder het deksel slip en lucht drogen terwijl het houden met een pincet. Plaats dekken slip cel-kant naar beneden op montage medium en laat uitharden enkele uren of O / N in het donker. Dicht de randen met nagellak en ga verder met beeldvorming. 6. Beeldvorming van Cellen met Olympus IX-81 Omgekeerde Microscoop Overzicht Voor het verwerven benutten we Slidebook (intelligent-imaging.com) software en een 100X, 1,45 NA, TIRFM olie doelstelling. Voor seriële GFP, DAPI, Cy3, Cy3.5 en Cy5 beeldvorming: Chroma filter sets (zie reagentia). Gebruik DAPI filterte vinden en te concentreren cellen. Stel deze als referentiepunt. Neem een ​​z-stack van beelden rond het referentiepunt wanneer de totale afstand is 5 uM met 0,2 uM grootte (25 vliegtuigen). Herhaal dit voor elke kleurstof kanaal (dwz elke probe set). Exporteren als een 16-bits TIFF voor beeldanalyse. 7. Image Analysis Overzicht (Singer Probes) Hieronder geven we een overzicht van computationele methoden die we gebruiken voor het analyseren van FISH afbeeldingen in MATLAB. De desbetreffende MATLAB functies gebruikt worden tussen haakjes aan de rechterkant. De algoritmes en drempels worden momenteel afgestemd op gegevens van Singer stijl sondes. Met behulp Stellaris stijl sondes zal enige aanpassing, met name voor de laatste filtering stap (7.8) nodig. Cell 15 Identificatie Afzonderlijke cellen van achtergrond met behulp van een algemene drempel op DAPI beelden 16 [graythresh]. Identificeer kernen met behulp van uitgebreide maxima functie [imextendedmax]. Segment cellen met kernen als zaden voor een waterscheiding algoritme [waterscheiding]. Vindplaatsen in elke fluorescentiekanaal Voeren tophat transformatie naar achtergrond normaliseren en signaal te verbeteren ruisverhouding [bwmorph]. Zoek maxima aan de in-focus laag (in de z-vlak) te identificeren voor elke spot [imregionalmax]. Filteren potentiële plekken met een lineaire fit model om een ​​radiaal verloop. Maatregel spot intensiteit en filter enkelvoudige versus meervoudige sonde signalen Monteer een 2D Gaussiaans profiel naar de plek in de eerder geconstateerde in-focus laag en raming intensiteit 17. Filteren op zwakke plekken met een drempel (op basis van histogram). Voor Singer soort probes is dit belangrijk, maar is minder voor Stellaris sondes. Telling spots in elke cel.