Extracellularly זיהוי תאי עצב מוטורי לשריר בברכת מוטור<em> Aplysia californica</em
Summary
בבעלי חיים עם נוירונים שזוהו גדולים (<em> לדוגמה</em> רכיכות), ניתוח של ברכות מוטוריות נעשה באמצעות טכניקות תאיות<sup> 1,2,3,4</sup>. לאחרונה, פתח טכניקת extracellularly לגרות ולהקליט נוירונים בודדים ב<em> Aplysia californica</em<sup> 5</sup>. כעת אנו מתארים פרוטוקול לשימוש בטכניקה זו כדי לזהות ולאפיין את תאי עצב מוטורי במוסך.
Abstract
בבעלי חיים עם נוירונים גדולים מזוהות (לדוגמא רכיכות), ניתוח של ברכות מוטוריות נעשה באמצעות טכניקות תאיות 1,2,3,4. לאחרונה, פתח טכניקת extracellularly לגרות ולהקליט נוירונים בודדים בAplysia californica 5. כעת אנו מתארים פרוטוקול לשימוש בטכניקה זו כדי לזהות ולאפיין את תאי עצב מוטורי במוסך.
טכניקה זו יש יתרונות חוץ תאית. אלקטרודות ראשית, תאיות יכולות לגרות ולהקליט הנוירונים דרך המעטה 5, כך שזה לא צריך להיות מוסר. לפיכך, הנוירונים יהיו בריאים בניסויים תאיים מאשר באלה תאיים. שנית, אם גרעינים הם לסובב על ידי הצמיד לנדן מתאים, אלקטרודות התאית יכולה לגשת לנוירונים בשני הצדדים של גנגליון, שהופך אותו קל יותר ויעיל יותר לזיהוי תאי עצב מרובים באותה ההכנה. שלישית, extracellular אלקטרודות לא צריכות לחדור לתאים, ובכך ניתן להעביר בקלות הלוך ושוב בין הנוירונים, גורמות פחות ניזק להם. זה שימושי במיוחד כאשר מנסה להקליט נוירונים מרובים במהלך דפוסים חוזרים מוטוריים שעלולים להימשך רק לדקות. אלקטרודות הרביעית, תאיות הן גמישות יותר מאשר תאי במהלך תנועות שרירים. אלקטרודות תאיות עשויות לשלוף אותו ולפגוע בתאי עצב במהלך התכווצויות שרירים. לעומת זאת, מאז אלקטרודות התאית נלחצות בעדינות על הנדן מעל הנוירונים, הם בדרך כלל להישאר מעל אותו נוירון בהתכווצויות שרירים, ולכן ניתן להשתמש בתכשירים שלמים יותר.
כדי לזהות תאי עצב מוטורי למאגר הרכב (בפרט, I1/I3 השריר בAplysia) באמצעות אלקטרודות תאיות, ניתן להשתמש בתכונות שאינם דורשות מדידות תאיות כקריטריונים: גודל ומיקום סומה, הקרנת אקסונלית, ועצבוב שרירים 4, 6,7. למאגר הרכב המסוים משמש להמחשת הטכניקה, הקליטו מעצבי buccal 2 ו 3 כדי למדוד תחזיות axonal, ומדדנו את כוחות ההתכווצות של שריר I1/I3 כדי לקבוע את הדפוס של עצבוב שרירים לתאי העצב המוטוריים הבודדים.
אנו מדגימים את התהליך המלא של הנוירונים מנוע זיהוי הראשון באמצעות עצבוב שרירים, אז העיתוי שלהם במהלך אפיון דפוסים מוטוריים, יצירת שיטת אבחון פשוטה לזיהוי מהיר. שיטת האבחון הפשוטה ומהירה יותר היא מעולה להכנות יותר שלמות, למשל בהכנת מסת buccal הושעתה 8 או 9 בגוף חי. תהליך זה יכול להיות מיושם גם בברכות מוטוריות אחרות 10,11,12 בAplysia או במערכות חיים אחרות 2,3,13,14.
Protocol
Representative Results
Discussion
בבעלי חיים עם נוירונים גדולים מזוהים, כגון רכיכות (לדוגמה, Lymnaea, הליקס, וAplysia), ניתוח של ברכות מוטוריות נעשה בדרך כלל באמצעות הקלטה תאית 1,2,3,4. בפרוטוקול זה, אנו מתארים תהליך לזיהוי תאי העצב המוטורי למאגר רכב באמצעות טכניקה ייחודית תאית. אנחנו השתמשנו במדידות ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי מענק NIH NS047073 ומענק NSF DMS1010434.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S671 | Biological, Certified |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217 | Certified ACS |
| Magnesium chloride hexahydrate | Acros Organics | 19753 | 99% |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Scientific | M63 | Certified ACS |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientifc | C79 | Certified ACS |
| Glucose (dextrose) | Sigma-Aldrich | G7528 | BioXtra |
| MOPS buffer | Acros Organics | 17263 | 99% |
| Carbachol | Acros Organics | 10824 | 99% |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | SS255 | Certified |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | SA49 | Certified |
| Single-barreled capillary glass | A-M Systems | 6150 | |
| Flaming-Brown micropipette puller model P-80/PC | Sutter Instruments | Filament used: FT345B | |
| Enamel coated stainless steel wire | California Fine Wire | 0.001D, coating h | |
| Household Silicone II Glue | GE | ||
| Duro Quick-Gel superglue | Henkel corp. | ||
| A-M Systems model 1700 amplifier | A-M Systems | Filter settings: 10-500 Hz for the I2 nerve/muscle; 300-500 Hz for all the other nerves | |
| Pulsemaster Multi-Channel Stimulator | World Precision Instruments | A300 | |
| Stimulus Isolator | World Precision Instruments | A360 | |
| AxoGraph X | AxoGraph Scientific | Software for recordings | |
| Gold Connector Pins | Bulgin | SA3148/1 | |
| Gold Connector Sockets | Bulgin | SA3149/1 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer | Dow Corning | ||
| 100 x 15 mm Crystalizing Dish | Pyrex | ||
| High Vacuum Grease | Dow Corning | ||
| Pipet Tips | Fisher Scientific | 21-375D | |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Modeling Clay | Sargent Art | 22-4400 | |
| Whisper Air Pump | Tetra | 77849 | |
| Aquarium Tubing | Eheim | 7783 | 12/16 mm |
| Elite Airstone | Hagen | A962 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Dumont #5 Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 |
References
- McCrohan, C. R., Benjamin, P. R. Synaptic relationships of the cerebral giant cells with motoneurones in the feeding system of Lymnaea stagnalis. J. Exp. Biol. 85, 169-186 (1980).
- Benjamin, P. R., Rose, R. M. Central generation of bursting in the feeding system of the snail, Lymnaea stagnalis. J. Exp. Biol. 80, 93-118 (1979).
- Peters, M., Altrup, U. Motor organization in pharynx of Helix pomatia. J. Neurophysiol. 52 (3), 389-409 (1984).
- Church, P. J., Cohen, K. P., Scott, M. L., Kirk, M. D. Peptidergic motoneurons in the buccal ganglia of Aplysia californica: immunocytochemical, morphological, and physiological characterizations. J. Comp. Physiol. A. 168 (3), 323-336 (1991).
- Lu, H., Chestek, C. A., Shaw, K. M., Chiel, H. J. Selective extracellular stimulation of individual neurons in ganglia. J. Neural. Eng. 5 (3), 287-309 (2008).
- Church, P. J., Lloyd, P. E. Expression of diverse neuropeptide cotransmitters by identified motor neurons in Aplysia. J. Neurosci. 11 (3), 618-625 (1991).
- Church, P. J., Lloyd, P. E. Activity of multiple identified motor neurons recorded intracellularly during evoked feedinglike motor programs in Aplysia. J. Neurophys. 72 (4), 1794-1809 (1994).
- McManus, J. M., Lu, H., Chiel, H. J. An In Vitro Preparation for Eliciting and Recording Feeding Motor Programs with Physiological Movements in Aplysia californica. J. Vis. Exp. (70), e4320 (2012).
- Cullins, M. J., Chiel, H. J. Electrode fabrication and implantation in Aplysia californica for multi-channel neural and muscular recordings in intact, freely behaving animals. J Vis. Exp. (40), e1791 (2010).
- Zhurov, Y., Weiss, K. R., Brezina, V. Tight or loose coupling between components of the feeding neuromusculature of Aplysia. J. Neurophysiol. 94 (1), 531-549 (2005).
- Hurwitz, I., Goldstein, R. S., Susswein, A. J. Compartmentalization of pattern-initiation and motor functions in the B31 and B32 neurons of the buccal ganglia of Aplysia californica. J. Neurophysiol. 71 (4), 1514-1527 (1994).
- Morton, D. W., Chiel, H. J. The timing of activity in motor neurons that produce radula movements distinguishes ingestion from rejection in Aplysia. J. Comp. Physiol. A. 173 (5), 519-536 (1993).
- Iles, J. F. Structure and synaptic activation of the fast coxal depressor motoneurone of the cockroach. Periplaneta americana. J. Exp. Biol. 56 (3), 647-656 (1972).
- Westerfield, M., McMurray, J. V., Eisen, J. S. Identified motoneurons and their innervation of axial muscles in the zebrafish. J. Neurosci. 6 (8), 2267-2277 (1986).
- Susswein, A. J., Rosen, S. C., Gapon, S., Kupfermann, I. Characterization of buccal motor programs elicited by a cholinergic agonist applied to the cerebral ganglion of Aplysia californica. J. Comp. Physiol. A. 179 (4), 509-524 (1996).
- Hurwitz, I., Neustadter, D., Morton, D. W., Chiel, H. J., Susswein, A. J. Activity patterns of the B31/B32 pattern initiators innervating the I2 muscle of the buccal mass during normal feeding movements in Aplysia californica. J. Neurophys. 75 (4), 1309-1326 (1996).
- Morton, D. W., Chiel, H. J. In vivo buccal nerve activity that distinguishes ingestion from rejection can be used to predict behavioral transitions in Aplysia. J. Comp. Physiol. A. 172 (1), 17-32 (1993).
- Warman, E. N., Chiel, H. J. A new technique for chronic single-unit extracellular recording in freely behaving animals using pipette electrodes. J. Neurosci. Methods. 57 (2), 161-169 (1995).
- Nargeot, R. N., Baxter, D. A., Byrne, J. H. Contingent-dependent enhancement of rhythmic motor patterns: an in vitro analog of operant conditioning. J. Neurosci. 17 (21), 8093-8105 (1997).
- Kandel, E. R. . Behavioral biology of Aplysia. , (1979).
- Scott, M. L., Govind, C. K., Kirk, M. D. Neuromuscular organization of the buccal system in Aplysia californica. J. Comp. Neurol. 312 (2), 207-222 (1991).
- Rosen, S. C., Miller, M. W., Cropper, E. C., Kupfermann, I. Outputs of radula mechanoafferent neurons in Aplysia are modulated by motor neurons, interneurons, and sensory neurons. J. Neurophysiol. 83 (3), 1621-1636 (2000).
- Rosen, S. C., Miller, M. W., Evans, C. G., Cropper, E. C., Kupfermann, I. Diverse synaptic connections between peptidergic radula mechanoafferent neurons and neurons in the feeding system of Aplysia. J. Neurophysiol. 83 (3), 1605-1620 (2000).
- Weiss, K. R., Chiel, H. J., Koch, U., Kupfermann, I. Activity of an identified histaminergic neuron, and its possible role in arousal of feeding behavior in semi-intact Aplysia. J. Neurosci. 6 (8), 2403-2415 (1986).
- Rosen, S. C., Teyke, T., Miller, M. W., Weiss, K. R., Kupfermann, I. Identification and characterization of cerebral-to-buccal interneurons implicated in the control of motor programs associated with feeding in Aplysia. J. Neurosci. 11 (11), 3630-3655 (1991).
- Jing, J., Weiss, K. R. Generation of variants of a motor act in a modular and hierarchical motor network. Curr. Biol. 15 (19), 1712-1721 (2005).
- Azizi, F., Lu, H., Chiel, H. J., Mastrangelo, C. H. Chemical neurostimulation using pulse code modulation (PCM) microfluidic chips. J. Neurosci. Methods. 192 (2), 193-198 (2010).
- Zhurov, Y., Proekt, A., Weiss, K. R., Brezina, V. Changes of internal state are expressed in coherent shifts of neuromuscular activity in Aplysia feeding behavior. J. Neurosci. 25 (5), 1268-1280 (2005).
- Baker, B. J., Kosmidis, E. K., Vucinic, D., Falk, C. X., Cohen, L. B., Djurisic, M., Zecevic, D. Imaging brain activity with voltage- and calcium-sensitive dyes. Cell. Mol. Neurobiol. 25 (2), 245-282 (2005).
- Fejtl, M., Stett, A., Nisch, W., Boven, K. -. H., Möller, A., Baudry, M., Taketani, M. On Micro-Electrode Array Revival. Advances in Network Electrophysiology Using Multi-Electrode Arrays. , 24-37 (2006).
