Injection stéréotaxique de micro-ARN exprimant lentivirus à la souris hippocampe CA1 Région et l'évaluation du résultat comportemental
Summary
Les microARN ont des rôles importants dans la structure et la fonction du cerveau. Nous décrivons ici une méthode pour appliquer miRNA hippocampe surexpression par injection stéréotaxique d'un lentivirus miRNA exprimant ingénierie. Cette approche peut servir comme un moyen relativement rapide pour évaluer l'<em> In vivo</em> Effets des miARN surexprimés dans des régions spécifiques du cerveau.
Abstract
Les microARN (miARN) sont de petites molécules d'ARN simple brin de réglementation à travers 22 nucléotides de long qui peut chaque cible de nombreux transcrits d'ARNm et dim un gène entier voie d'expression par la destruction d'induction et / ou inhibition de la traduction de ces objectifs. Plusieurs miARN jouent un rôle clé dans le maintien de la structure et la fonction neuronale et dans les fonctions cérébrales de haut niveau, et les méthodes sont recherchés pour manipuler leurs niveaux pour explorer ces fonctions. Ici, nous présentons une méthode in vivo directe pour examiner les conséquences cognitives de miARN forcées en excès chez les souris par injection stéréotaxique de particules virales miRNA-encodage. Plus précisément, le protocole actuel consiste à injecter dans la région CA1 hippocampique, qui contribue à la consolidation des mammifères de la mémoire, l'apprentissage, et les réactions au stress, et offre un site d'injection pratique. Les coordonnées sont mesurées selon le bregma de la souris et de la perfusion du virus est contrôlée et maintenue très lent numériquement.Après l'injection, la plaie de la chirurgie est scellé et les animaux récupérer. Les lentivirus codant silencieux des ARNm cibles correspondantes servent à impliquer l'interaction des miARN / cible spécifique responsable de l'effet observé, avec des souris naïves, des souris injectées avec une solution saline et des souris injectées avec des vecteurs de lentivirus «vides» comme témoins. Un mois après l'injection, les animaux sont examinés dans le labyrinthe d'eau de Morris (MWM) pour évaluer leur apprentissage de la navigation et des capacités de mémoire. Le MWM est un réservoir rond rempli d'eau colorée avec une petite plate-forme immergée 1 cm en dessous de la surface de l'eau. Des repères visuels d'équilibre autour de la cuve pour permettre la navigation spatiale (sonore et le champ magnétique de la terre peut aussi aider les animaux dans la navigation). surveillance par caméra vidéo permet de mesurer le chemin de baignade et le temps de trouver et le montant de la plate-forme. La souris est d'abord enseigné que le montage de la plate-forme cachée offre une évasion de la baignade forcée, il est ensuite testé pour l'utilisation de cette évasion et fnfin, la plateforme est enlevé et les tests de sonde examiner si la souris se souvient de son emplacement précédent. Des tests répétés sur plusieurs jours consécutifs soulignent une amélioration des performances des souris testées à des latences plus courtes pour trouver et monter la plate-forme, et les routes plus directes que pour atteindre la plate-forme ou son emplacement. Le défaut de montrer cette amélioration représente une déficience apprentissage et la mémoire et / ou de l'anxiété, qui peut ensuite être testé spécifiquement (par exemple dans le labyrinthe surélevé). Cette approche permet la validation des miARN spécifiques et les transcriptions des cibles dans le développement cognitif étudié et / ou des processus liés au stress.
Introduction
Le rôle des miARN particulier dans le fonctionnement du système nerveux a récemment été contestée par injection lentiviral dans plusieurs études. MiRNAs ont été trouvés à être crucial pour le maintien et remodeler la structure synapse 1, synaptogénèse 2 et le remodelage et la maintenance 3 synapse. Ces études suggèrent fortement que les miARN sont engagés, via des effets régulateurs multileveled à la fois dans la formation et dans le maintien de la sortie principale du système nerveux, les fonctions cognitives. Injection stéréotaxique de particules lentivirus dans des régions spécifiques du cerveau des rongeurs permet la recherche de modifications de la morphologie synapse et l'activité neuronale, et a été utilisée pour établir la signification fonctionnelle des transcriptions surexprimés 4,5. L'infection directe des neurones dans les zones du cerveau bien définis avec des miRNA exprimant lentivirus peut être impliqué dans des études sur le vieillissement, les troubles cérébraux et les maladies neurodégénératives, les études de miRNAs dans le domaine de la régulation comportementale 6-8 sont dans un état beaucoup moins avancé, et l'injection stéréotaxique de miRNA exprimant particules de lentivirus suivies par des tests de comportement peut être utile à de telles fins. Une méthode beaucoup plus laborieux pour induire sur-ou sous-expression implique génétiquement knock-in ou souris knock-out. Systèmes génétiques peuvent en outre permettre un contrôle conditionnel et temporelle de l'expression (par exemple, Cre-Lox, les systèmes Tet), mais ceux-ci difficilement offrir la spécificité spatiale de la procédure d'injection et il ya presque toujours une certaine quantité de perméabilité. En outre, les procédures techniques ne nécessitent pas d'intervention chirurgicale et peuvent être utilisés dans des laboratoires avec relativement bonne reproductibilité, mais ils sont plus lents et exigent beaucoup plus de ressources humaines et financières. En outre, le contrôle temporel de la sous-expression chez les souris injectées sur-ou est beaucoup plus précis par rapport à des souris génétiquement modifiées.
Protocol
Representative Results
Discussion
Injection stéréotaxique d'un lentivirus est une méthode relativement rapide pour l'évaluation in vivo à la fois pour la régulation des gènes différents et miARN haut ou. La principale alternative est une souris génétiquement modifiée qui est une technique consommant beaucoup plus laborieux et puis injection de lentivirus direct. En outre, la réglementation en place, en injection de lentivirus, survient à un moment spécifique chez la souris adulte et ne comprend pas toute possibilité de d?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été soutenue par le Centre Edmond Safra et Lily pour Brain Sciences (SB bourse), The Heritage biomédicale Programme de partenariat des sciences héritage de la Fondation Israël Sciences (Grant No. 378/11, le SH) et la Fondation allemande pour la recherche scientifique israélienne Recherche et Développement (GIF) (Grant No. 1093-32.2/2010, le SH).
Materials
| Equipment | |||
| Rodent weigh scale | Burtons (UK) | 115-455 | |
| heating pad | FIRstTechnology | DCT-25 | |
| trimming machine | Stoelting | 51465 | |
| stereotact | Stoelting | 51730 | |
| Scalpel and blades | Kent scientific | INS500348 | |
| Harland syringe | Hamilton | 7632-01 | |
| driller | Stoelting | 51449 | |
| digital pump | Harvard apparatus | 704507 | |
| Water tank and platform | Stoelting | 60135 |
| Reagents | |||
| ketamine | Vetoquinol(Lure France) | 3055503 | |
| domitor | Orion pharma | 107140-10 | |
| Rimadyl | Pfizer animal health | 24751 | |
| moisture ointment – Synthomycine 5% | Rekah Pharmaceutical | 195 | |
| histoacryl | Braun | 112101 | |
| saline | Sigma Aldrich | D8662 |
References
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