Se describe una sola célula de alto rendimiento de ensayo para medir la citotoxicidad de las células T cuando se incuba con las células diana tumorales. Este método emplea una matriz densa, elastómero de sub-nanolitros pozos (~ 100.000 pozos / matriz) para confinar espacialmente las células T y las células diana en proporciones definidas, y está acoplado a la microscopía de fluorescencia para monitorizar efector-diana conjugación y posterior apoptosis.
Inmunoterapia del cáncer puede aprovechar la especificidad de la respuesta inmune para atacar y eliminar tumores. Terapia celular adoptiva (ACT) sobre la base de la transferencia adoptiva de células T modificadas genéticamente para expresar un receptor de antígeno quimérico (CAR) ha mostrado una promesa considerable en los ensayos clínicos 1-4. Hay varias ventajas de utilizar CAR + células T para el tratamiento de cánceres, incluyendo la capacidad de apuntar no-MHC antígenos restringidos y para funcionalizar las células T para la supervivencia óptima, mensajeras y persistencia dentro del huésped, y finalmente para inducir la apoptosis de CAR + células T en el caso de toxicidad para el huésped 5.
La delineación de las funciones óptimas de CAR + células T asociados con un beneficio clínico es esencial para el diseño de la próxima generación de ensayos clínicos. Los recientes avances en imágenes de animales vivos como microscopía multifotónica han revolucionado el estudio de la función celular inmune in vivo 6,7. Aunque estos estudios han avanzado nuestra comprensión de las funciones de las células T in vivo, las células T ACT basada en ensayos clínicos, requiere la necesidad de vincular las características moleculares y funcionales de las células T preparaciones de pre-infusión con eficacia clínica después de la infusión, utilizando en ensayos in vitro de vigilancia de células T como las funciones, la citotoxicidad y la secreción de citoquinas. Estándar de citometría de flujo basados en ensayos han sido desarrollados que determinan el funcionamiento general de las poblaciones de células T a nivel de una sola célula, pero estos no son adecuados para el seguimiento de la formación de conjugado y tiempos de vida o la capacidad de la misma célula para matar múltiples objetivos 8.
Arrays microfabricados diseñado en polímeros biocompatibles, como el polidimetilsiloxano (PDMS) son un método particularmente atractivo para confinar espacialmente efectores y objetivos en volúmenes pequeños 9. En combinación con la microscopía de fluorescencia automatizado time-lapse, aunqueusands de interacciones efector-objetivo pueden ser controlados simultáneamente por los distintos pozos de imágenes de una gran nanowell. Se presenta aquí una metodología de alto rendimiento para el seguimiento de la citotoxicidad de células T mediada a nivel de una sola célula que puede aplicarse ampliamente para estudiar la funcionalidad de las células T citolítica.
Hemos esbozado el protocolo para un alto rendimiento de una sola célula ensayo citolítico habilitado a través de co-incubación de los efectores y metas en las matrices de nanowells (Figura 1). Además de rendimiento de una de las principales ventajas de la técnica es la capacidad de controlar efectora mediada por la citotoxicidad contra células diana deseadas sin la necesidad de la ingeniería de las células diana que a su vez permite el uso de células tumorales autólogas o apareadas / primaria…
The authors have nothing to disclose.
Las investigaciones realizadas en esta publicación fue apoyada por el Instituto Nacional del Cáncer de los Institutos Nacionales de la Salud bajo el número Award R01CA174385. El contenido es de exclusiva responsabilidad de sus autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.
Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
RPMI-1640 w/o L-glutamine | Cellgro | 15-040-CV | |
Penicillin-streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | 10,000 I.U. Penicillin 10,000 μg/ml Streptomycin |
L-glutamine | Cellgro | 25-005-CI | 200 mM solution |
HEPES | Sigma Aldrich | H3537 | 1M |
Fetal bovine serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | Lot tested |
Cell Tracker Red Stain | Invitrogen | C34552 | 50 μg |
Vybrant DyeCycle Violet Stain | Invitrogen | V35003 | 5 mM |
SYTOX green Nucleic Acid Stain | Invitrogen | S7020 | 5 mM |
Annexin V-Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A23204 | 500 μl |
Dulbecco’s PBS | Cellgro | 21-031-CV | 500 ml |
Noble agar | DIFCO | 2M220 | 100 g |
Trypan Blue | Sigma Aldrich | T8154 | 0.4% liquid, sterile filtered |
Hemocytometer | Hausser Scientifics | 1492 | Bright line |
4-well plate | Thermo Fisher | 167603 | |
Harrick Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | Basic plasma cleaner |
Observer.Z1 | ZEISS | Fluorescent microscope (works with the three parts below) | |
Lambda 10-3 | Sutter Instrument | Filter controller | |
Lambda DG-4 | Sutter Instrument | Ultra-High-Speed Wavelength switcher | |
Hamamatsu EM-CCD Camera | Hamamatsu | C9100-13 | CCD-Microscope camera |
15 ml conical tube | BD Falcon | 352097 | |
50 ml conical tube | VWR | 3282-345-300 | |
Nikon Biostation | Nikon Instruments Inc. | Biostation IM | |
Glass bottom culture dish | MatTek Corporation | P35G-0 | 35 mm petri dish, 10 mm microwell |