Количественные высокой пропускной Single-клеточной цитотоксичности анализа для Т-клеток
Summary
Мы описываем одноклеточных высокой пропускной способностью анализа для оценки цитотоксичности Т-клеток при инкубации с опухолевыми клетками-мишенями. Этот метод используется плотная, эластомерных массив к югу от nanoliter скважин (~ 100000 скважин / массив) для пространственно ограничить Т-клетки и клетки-мишени в определенных соотношениях и соединен с флуоресцентной микроскопии для контроля эффекторных-целевого сопряжения и последующего апоптоза.
Abstract
Иммунотерапии рака могут использовать специфику иммунного ответа на цель и устранения опухоли. Приемные клеточная терапия (АКТ) на основе приемных передачи Т-клеток, генетически модифицированные, чтобы выразить химерный рецептор антигена (CAR) показали значительные перспективы в клинических испытаниях 1-4. Есть несколько преимуществ использования CAR + Т-клеток для лечения рака, включая возможность направлять не-MHC антигенов и ограниченных к функционализации Т-клетки для оптимального выживания, самонаведения и настойчивость в принимающей, и, наконец, чтобы индуцировать апоптоз CAR + Т-клетки в случае хозяин токсичности 5.
Разграничении оптимальной функции CAR + Т-клеток, связанных с клинические преимущества имеет важное значение для разработки следующего поколения клинических испытаний. Последние достижения в области изображений живых животных, как многофотонной микроскопии революцию в изучении функции иммунных клеток яп естественных 6,7. Хотя эти исследования расширили наше понимание Т-клеточной функции в живом организме, Т-клеточной основе СПО в клинических испытаниях требует необходимость увязки молекулярные и функциональные особенности Т-клеточных препаратов предварительной инфузии с клинической эффективности после инфузии, с использованием в лабораторных анализов мониторинг Т-клеточной функции, такие как, цитотоксичности и секрецию цитокинов. Стандартный проточной цитометрии на основе анализа были разработаны, которые определяют общее функционирование популяций Т-клеток в одной клетке уровне, но они не пригодны для мониторинга формирования и сопряженных жизни или способности и той же клетке, чтобы убить несколько целей 8.
Microfabricated массивов разработан в биосовместимые полимеры, такие как полидиметилсилоксана (PDMS) являются особенно привлекательным методом пространственно ограничить эффекторов и мишеней в небольших объемах 9. В сочетании с автоматической покадровой флуоресцентной микроскопии, Тхоusands эффекторных-целевого взаимодействия могут быть проверены одновременно визуализации отдельных скважин из массива nanowell. Мы приведем здесь высокой пропускной методологии мониторинга Т-клеточной цитотоксичности на одной клеточном уровне, которые могут быть широко применены к изучению цитолитического функциональности Т-клеток.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы наметили протокол для высокой пропускной способности одноклеточных цитолитического анализа включается с помощью совместной инкубации эффекторов и мишеней в массивах nanowells (рис. 1). В дополнение к пропускной Основным преимуществом метода является возможность контролирова…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Исследования в этом сообщило издание было поддержано Национальным институтом рака Национального института здоровья под Премия Количество R01CA174385. Этот материал предназначен исключительно ответственности авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения Национального института здоровья.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| RPMI-1640 w/o L-glutamine | Cellgro | 15-040-CV | |
| Penicillin-streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | 10,000 I.U. Penicillin 10,000 μg/ml Streptomycin |
| L-glutamine | Cellgro | 25-005-CI | 200 mM solution |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3537 | 1M |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | Lot tested |
| Cell Tracker Red Stain | Invitrogen | C34552 | 50 μg |
| Vybrant DyeCycle Violet Stain | Invitrogen | V35003 | 5 mM |
| SYTOX green Nucleic Acid Stain | Invitrogen | S7020 | 5 mM |
| Annexin V-Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A23204 | 500 μl |
| Dulbecco’s PBS | Cellgro | 21-031-CV | 500 ml |
| Noble agar | DIFCO | 2M220 | 100 g |
| Trypan Blue | Sigma Aldrich | T8154 | 0.4% liquid, sterile filtered |
| Hemocytometer | Hausser Scientifics | 1492 | Bright line |
| 4-well plate | Thermo Fisher | 167603 | |
| Harrick Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | Basic plasma cleaner |
| Observer.Z1 | ZEISS | Fluorescent microscope (works with the three parts below) | |
| Lambda 10-3 | Sutter Instrument | Filter controller | |
| Lambda DG-4 | Sutter Instrument | Ultra-High-Speed Wavelength switcher | |
| Hamamatsu EM-CCD Camera | Hamamatsu | C9100-13 | CCD-Microscope camera |
| 15 ml conical tube | BD Falcon | 352097 | |
| 50 ml conical tube | VWR | 3282-345-300 | |
| Nikon Biostation | Nikon Instruments Inc. | Biostation IM | |
| Glass bottom culture dish | MatTek Corporation | P35G-0 | 35 mm petri dish, 10 mm microwell |
References
- Louis, C. U., et al. Antitumor activity and long-term fate of chimeric antigen receptor-positive T cells in patients with neuroblastoma. Blood. 118, 6050-6056 (2011).
- Savoldo, B., et al. CD28 costimulation improves expansion and persistence of chimeric antigen receptor-modified T cells in lymphoma patients. J. Clin. Invest. 121, 1822-1826 (2011).
- Kalos, M., et al. T cells with chimeric antigen receptors have potent antitumor effects and can establish memory in patients with advanced leukemia. Sci. Transl. Med. 3, 95ra73 (2011).
- Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells in Chronic Lymphoid Leukemia. N. Engl. J. Med. , (2011).
- Restifo, N. P., Dudley, M. E., Rosenberg, S. A. Adoptive immunotherapy for cancer: harnessing the T cell response. Nat. Rev. Immunol. 12, 269-281 (2012).
- Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
- Sumen, C., Mempel, T. R., Mazo, I. B., von Andrian, U. H. Intravital microscopy: visualizing immunity in context. Immunity. 21, 315-329 (2004).
- Lamoreaux, L., Roederer, M., Koup, R. Intracellular cytokine optimization and standard operating procedure. Nat. Protoc. 1, 1507-1516 (2006).
- Varadarajan, N., et al. A high-throughput single-cell analysis of human CD8+ T cell functions reveals discordance for cytokine secretion and cytolysis. J. Clin. Invest. 121, 4322-4331 (2011).
- Ogunniyi, A. O., Story, C. M., Papa, E., Guillen, E., Love, J. C. Screening individual hybridomas by microengraving to discover monoclonal antibodies. Nat. Protoc. 4, 767-782 (2009).
- Streeck, H., Frahm, N., Walker, B. D. The role of IFN-gamma Elispot assay in HIV vaccine research. Nat. Protoc. 4, 461-469 (2009).
- Varadarajan, N., et al. Rapid, efficient functional characterization and recovery of HIV-specific human CD8+ T cells using microengraving. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 3885-3890 (2012).
- Makedonas, G., Betts, M. R. Living in a house of cards: re-evaluating CD8+ T-cell immune correlates against HIV. Immunol. Rev. 239, 109-124 (2011).
- Telford, W. G., Komoriya, A., Packard, B. Z. Multiparametric analysis of apoptosis by flow and image cytometry. Methods Mol. Biol. 263, 141-160 (2004).
