Nous décrivons une cellule unique à haut débit essai pour mesurer la cytotoxicité des lymphocytes T lorsqu'ils sont incubés avec les cellules cibles tumorales. Ce procédé utilise une matrice élastomère dense, de puits sous-nanolitres (~ 100.000 puits / matrice) à l'espace confiner les cellules T et les cellules cibles à des rapports définis et est couplée à la microscopie par fluorescence pour surveiller effecteur-cible conjugaison et l'apoptose subséquente.
L'immunothérapie du cancer permet d'exploiter la spécificité de la réponse immunitaire à cibler et à éliminer les tumeurs. Thérapie cellulaire adoptive (ACT) basé sur le transfert adoptif de lymphocytes T génétiquement modifiées pour exprimer un récepteur d'antigène chimérique (CAR) a montré très prometteur dans les essais cliniques 1-4. Il ya plusieurs avantages à utiliser CAR + lymphocytes T pour le traitement de cancers, y compris la capacité de cibler des antigènes du CMH non réglementées et pour fonctionnaliser les lymphocytes T pour la survie optimale, tête chercheuse et de la persistance dans l'hôte, et enfin à induire l'apoptose de CAR + Les cellules T dans le cas de 5 toxicité hôte.
La délimitation des fonctions optimales de CAR + lymphocytes T associés à un bénéfice clinique est essentielle pour concevoir la prochaine génération des essais cliniques. Les progrès récents de l'imagerie des animaux vivants comme la microscopie multiphotonique ont révolutionné l'étude de la fonction des cellules immunitaires in vivo 6,7. Bien que ces études ont fait progresser notre compréhension des fonctions des cellules T in vivo, des cellules T ACT basée sur des essais cliniques nécessite la nécessité de relier les caractéristiques moléculaires et fonctionnelles des cellules T préparations pré-infusion avec une efficacité clinique après la perfusion, en utilisant en tests in vitro des cellules T surveillance des fonctions telles que, la cytotoxicité et la sécrétion de cytokines. Standard de cytométrie en flux ont été basés sur des tests élaborés pour déterminer le fonctionnement global des populations de cellules T au niveau d'une seule cellule, mais celles-ci ne sont pas appropriés pour le suivi et la formation de conjugués vie ou la capacité de la cellule même de tuer plusieurs cibles 8.
Microfabriqués tableaux conçus dans des polymères biocompatibles tels que le polydiméthylsiloxane (PDMS) constituent une méthode particulièrement attrayante pour limiter l'espace effecteurs et des cibles dans de petits volumes 9. En combinaison avec la microscopie à fluorescence automatisé time-lapse, quoiqueusands d'effecteur-cible interactions peuvent être surveillés simultanément par des puits individuels d'imagerie d'un tableau nanowell. Nous présentons ici une méthode à haut débit pour la surveillance cytotoxicité à médiation cellulaire T-au niveau d'une seule cellule qui peut être largement appliquée à l'étude de la fonctionnalité des lymphocytes T cytolytiques.
Nous avons décrit le protocole pour un haut débit seule cellule d'essai cytolytique activé via la co-incubation des effecteurs et des cibles dans les tableaux de nanowells (figure 1). En plus de débit d'un avantage majeur de cette technique est la possibilité de surveiller effecteur cytotoxicité à médiation contre des cellules cibles désirées sans avoir besoin de l'ingénierie cellulaire cible qui à son tour permet l'utilisation de autologues ou appariés / primaire cellules t…
The authors have nothing to disclose.
La recherche publiée dans la présente publication a été soutenue par le National Cancer Institute des National Institutes of Health sous R01CA174385 Nombre Award. Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne reflètent pas nécessairement les vues officielles de la National Institutes of Health.
Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
RPMI-1640 w/o L-glutamine | Cellgro | 15-040-CV | |
Penicillin-streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | 10,000 I.U. Penicillin 10,000 μg/ml Streptomycin |
L-glutamine | Cellgro | 25-005-CI | 200 mM solution |
HEPES | Sigma Aldrich | H3537 | 1M |
Fetal bovine serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | Lot tested |
Cell Tracker Red Stain | Invitrogen | C34552 | 50 μg |
Vybrant DyeCycle Violet Stain | Invitrogen | V35003 | 5 mM |
SYTOX green Nucleic Acid Stain | Invitrogen | S7020 | 5 mM |
Annexin V-Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A23204 | 500 μl |
Dulbecco’s PBS | Cellgro | 21-031-CV | 500 ml |
Noble agar | DIFCO | 2M220 | 100 g |
Trypan Blue | Sigma Aldrich | T8154 | 0.4% liquid, sterile filtered |
Hemocytometer | Hausser Scientifics | 1492 | Bright line |
4-well plate | Thermo Fisher | 167603 | |
Harrick Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | Basic plasma cleaner |
Observer.Z1 | ZEISS | Fluorescent microscope (works with the three parts below) | |
Lambda 10-3 | Sutter Instrument | Filter controller | |
Lambda DG-4 | Sutter Instrument | Ultra-High-Speed Wavelength switcher | |
Hamamatsu EM-CCD Camera | Hamamatsu | C9100-13 | CCD-Microscope camera |
15 ml conical tube | BD Falcon | 352097 | |
50 ml conical tube | VWR | 3282-345-300 | |
Nikon Biostation | Nikon Instruments Inc. | Biostation IM | |
Glass bottom culture dish | MatTek Corporation | P35G-0 | 35 mm petri dish, 10 mm microwell |