Summary

Gerichte Labeling van neuronen in een specifiek functioneel Micro-domein van de neocortex door combinatie van intrinsieke signaal en twee-foton Imaging

Published: December 12, 2012
doi:

Summary

Een werkwijze wordt beschreven voor het labelen neuronen met fluorescente kleurstoffen in voorafbepaalde functionele micro-domeinen van de neocortex. Eerst wordt intrinsieke optisch imaging gebruikt om een ​​functionele kaart te verkrijgen. Dan twee-foton microscopie wordt gebruikt om het etiket en beeld neuronen binnen een micro-domein van de kaart.

Abstract

In de primaire visuele cortex van de niet-knaagdier zoogdieren, worden neuronen geclusterd op basis van hun voorkeur voor stimuli functies zoals oriëntatie 1-4, richting 5-7, oculaire dominantie 8,9 en binoculaire dispariteit 9. Oriëntatie selectiviteit is de meest bestudeerde functie en een doorlopende kaart met een quasi-periodieke lay-out voor de gewenste oriëntatie aanwezig is in de gehele primaire visuele cortex 10,11. Integratie van de synaptische, cellulaire en netwerk bijdragen die leiden tot stimulans selectieve reacties in deze functionele kaarten vereist de hybridisatie van beeldvormende technieken die sub-micron overspannen millimeter ruimtelijke schalen. Bij conventionele intrinsieke signaal optische, kan de algemene indeling van functionele kaarten over het gehele oppervlak van de visuele cortex bepaald 12. De ontwikkeling van in vivo twee-foton microscopie met calcium gevoelige kleurstoffen laat toe bepalen synaptic-ingang te komen tot individuele dendritische spines 13 of een recordaantal activiteiten tegelijkertijd uit honderden individuele neuronale cellichamen 6,14. Bijgevolg combineert intrinsieke signaal beeldvorming met de sub-micron ruimtelijke resolutie van twee-foton microscopie biedt de mogelijkheid om een ​​precies welke dendritische cellen segmenten en bijdragen aan de micro-domein van elke functionele kaart in de neocortex. Hier laten we zien een hoge opbrengst methode voor het snel verkrijgen van een corticale oriëntatie kaart en tot een specifieke micro-domein in deze functionele kaart voor het labelen neuronen met fluorescente kleurstoffen in een niet-knaagdier zoogdier. Met dezelfde microscoop gebruikt voor twee-foton beeldvorming, maken we eerst een oriëntatie kaart met behulp van intrinsieke signaal optische beeldvorming. Vervolgens laten we zien hoe je een micro-domein van belang het gebruik van een micropipet geladen met kleurstof om ofwel label richten op een bevolking van neuronale cellichamen of label van een enkel neuron zodanig dat dendrieten, stekels en axonen zijn zichtbaar invivo. Onze verfijningen ten opzichte van eerdere methoden vergemakkelijken onderzoek van neuronale structuur-functie relaties met subcellulaire resolutie in het kader van neocorticale functionele architecturen.

Protocol

1. Chirurgische Voorbereiding Laten anesthesie en permanent toezicht op de hartslag, eindigen getijden CO 2, EEG, en de temperatuur. Alle procedures werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de Medische Universiteit van South Carolina en waren gebaseerd op die we eerder gepubliceerde 9,15. Maak de dorsale oppervlak van de schedel door het snijden van de huid met een scalpel. Prepareer het bindweefsel bovenop het bot met behulp van een Brudon cur…

Representative Results

Om de precisie van onze dye labeling methoden illustreren, gericht op de kleinste micro-domein van elke bekende functionele kaart in de knaagdieren neocortex. Dun doorspekt het hele oriëntatie kaart in de primaire visuele cortex zijn singulariteiten. Deze komen op de plaatsen waar alle gewenste richtingen samenkomen, zodanig dat in valse kleuren kaarten van voorkeursrichting, de regio's rond de singulariteit eruit "pinwheels" (Figuur 2A-B). Een pinwheel per craniotomie is geselecteerd voo…

Discussion

We een methode om de labeling van neuronale cellichamen (of dendrieten en axonen) in vooraf bepaalde functionele micro-domeinen van de neocortex richten. Fuserende intrinsieke optisch beeldvorming met twee-foton microscopie biedt de mogelijkheid te bepalen welke cellen bij synapsen en de micro-domein van elke functionele kaart, of neuronale selectiviteit correleert met de locatie van de neuron in een functionele kaart en de neuronale circuitcomponenten die veranderen met visuele ervaring 7 of de toepassing va…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Eye Institute R01EY017925 en R21EY020985 en financiering van de Dana & Whitehall Foundations naar PK We hebben ook Matthew Petrella bedanken voor hulp bij chirurgische procedures; Grace Dion voor het traceren van de dendrieten getoond in figuur 5A en Pratik Chhatbar voor commentaar op het manuscript.

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalogue Number Comments
      1. Life support/experiment prep
Isoflurane Webster Vet NDC 57319-474-05  
Isoflurane vaporizer Midmark VIP 3000  
Feedback regulated heating blanket Harvard Apparatus 50-7079F  
ECG monitor Digicare Biomedical LifeWindow Lite  
EEG amplifier A-M Systems 1800  
EEG display monitor Hewlett Packard 78304A  
End tidal CO2 monitor Respironics Novametrix Capnoguard 1265 Optimize ventilation
Carbide drill burrs for drilling bone Henry Schein fine (0.5 mm tip) and coarse (1.25 mm tip)  
Cement for headplate/chamber Dentsply 675571, 675572  
Black Powder Tempera Paint Sargent Art Inc. 22-7185 Add to cement to improve light shielding and reduce reflections
Agarose – Type III-A Sigma A9793 For minimizing pulsations during intrinsic signal and two-photon imaging
Coverglass: 5 or 8 mm diameter, 0.17 mm thickness World Precision Instruments 502040, 502041 For minimizing pulsations during imaging, the coverglass may be cut as needed
Brudon curettes George Tiemann 105-715-0, 105-715-3 Cleaning skull surface
Bone wax Ethicon W31G Quickly stop bleeding
Cotton Tipped Applicator Electron Microscopy Sciences 72308-05 Clean and dry bone surface
Dumont #5CO Forceps Fine Science Tools 11295-20 Grab individual layers of dura or pia
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-03 Cut dura
Gelfoam Pfizer 09-0396-05 To stop bleeding on the dura
Absorption spears Fine Science Tools 18105-01 Ultra-fast and lint-free wicking of CSF
Blackout material Thorlabs BK5 Shield craniotomy
      2. Dye preparation / injection
Dimethyl Sulphoxide (DMSO) Sigma D2650  
Pluronic Sigma P2443  
Oregon Green 488 Bapta-1 AM Invitrogen O6807 Calcium indicator
Alexa Fluor 594 Invitrogen A10438  
Centrifugal filter (0.45 μm pore size) Millipore UFC30HV00 To remove impurities before injection
Glass pipette puller Sutter Instruments P97  
Borosilicate glass filamented capillary (1.5 mm outer diameter) World Precision Instruments 1B150F-4 Dye ejection pipette
Microloader Eppendorf 5242 956 003 For loading dye into pipette
Micromanipulator Sutter Instruments MP-285 To position pipette
Pressure pulse controller Parker Hannifin PicoSpritzer III For pressure injection of the dye
Single-cell electroporator Molecular Devices Axoporator 800A For electroporation of the dye
      3. Intrinsic imaging
4x Objective (0.13 NA, 17 mm WD) Olympus UPLFLN4X  
Intrinsic hardware / software Optical Imaging Inc. Imager 3001 / VDAQ VDAQ software is used for episodic imaging
CCD Camera Adimec Adimec-1000  
Light source power supply KEPCO ATE 15-15M  
Light source Optical Imaging Inc. HAL 100 Light intensity at the cortical surface is 3-5 mW
Green filter (for vascular image) Optical Imaging Inc. λ = 546 nm (bandpass 30 nm) For reference image of surface vasculature
Red filter (for intrinsic signal) Optical Imaging Inc. λ = 630 nm (bandpass 30 nm) To collect intrinsic signals
Heat filter Optical Imaging Inc. KG-1  
      4. Two-photon rig/imaging
Two-photon microscope and software Prairie Technologies   See Shen et al. 2012 for light path, filters and laser power
Ti:Sapphire laser Spectra-Physics Mai Tai XF  
20x (0.5 NA; 3.5 mm WD) Olympus UMPLFLN20X 0.5 NA objective is used only for aligning pipette over the craniotomy (not for two photon imaging)
20x (1.0 NA; 2.0 mm WD) Olympus XLUMPLFLN20X  
40x (0.8 NA; 3.3 mm WD) Olympus LUMPLFLN40X/IR  
Air table Newport ST-200 Isolates preparation from external vibrations
xy stage Mike’s Machine Co. (Attleboro, MA)   Experimental subject and Sutter micromanipulator placed on xy stage
     
Recipes
Artificial Cerebro-Spinal Fluid NaCl (135 mM), KCl (5.4 mM), MgCl2 (1.0 mM), CaCl2 (1.8 mM), HEPES (5 mM), pH 7.4
Pipette Solution14 NaCl (150 mM), KCl (2.5 mM), HEPES (10 mM), pH 7.4

References

  1. Blasdel, G. G., Salama, G. Voltage-sensitive dyes reveal a modular organization in monkey striate cortex. Nature. 321, 579-585 (1986).
  2. Grinvald, A., Lieke, E., Frostig, R. D., Gilbert, C. D., Wiesel, T. N. Functional architecture of cortex revealed by optical imaging of intrinsic signals. Nature. 324, 361-364 (1986).
  3. Bonhoeffer, T., Grinvald, A. Iso-orientation domains in cat visual cortex are arranged in pinwheel-like patterns. Nature. 353, 429-431 (1991).
  4. Ohki, K., et al. Highly ordered arrangement of single neurons in orientation pinwheels. Nature. 442, 925-928 (2006).
  5. Shmuel, A., Grinvald, A. Functional organization for direction of motion and its relationship to orientation maps in cat area 18. J. Neurosci. 16, 6945-6964 (1996).
  6. Ohki, K., Chung, S., Ch’ng, Y. H., Kara, P., Reid, R. C. Functional imaging with cellular resolution reveals precise micro-architecture in visual cortex. Nature. 433, 597-603 (2005).
  7. Li, Y., Van Hooser, S. D., Mazurek, M., White, L. E., Fitzpatrick, D. Experience with moving visual stimuli drives the early development of cortical direction selectivity. Nature. 456, 952-956 (2008).
  8. Bonhoeffer, T., Kim, D. S., Malonek, D., Shoham, D., Grinvald, A. Optical imaging of the layout of functional domains in area 17 and across the area 17/18 border in cat visual cortex. Eur. J. Neurosci. 7, 1973-1988 (1995).
  9. Kara, P., Boyd, J. D. A micro-architecture for binocular disparity and ocular dominance in visual cortex. Nature. 458, 627-631 (2009).
  10. da Costa, N. M., Martin, K. A. Whose Cortical Column Would that Be. Frontiers in Neuroanatomy. 4, 16 (2010).
  11. Kaschube, M., et al. Universality in the evolution of orientation columns in the visual cortex. Science. 330, 1113-1116 (2010).
  12. Villeneuve, M. Y., Vanni, M. P., Casanova, C. Modular organization in area 21a of the cat revealed by optical imaging: comparison with the primary visual cortex. 神经科学. 164, 1320-1333 (2009).
  13. Chen, X., Leischner, U., Rochefort, N. L., Nelken, I., Konnerth, A. Functional mapping of single spines in cortical neurons in vivo. Nature. 475, 501-505 (2011).
  14. Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 7319-7324 (2003).
  15. Shen, Z., Lu, Z., Chhatbar, P. Y., O’Herron, P., Kara, P. An artery-specific fluorescent dye for studying neurovascular coupling. Nat. Methods. 9, 273-276 (2012).
  16. Nevian, T., Helmchen, F. Calcium indicator loading of neurons using single-cell electroporation. Pflugers Archiv. 454, 675-688 (2007).
  17. Kitamura, K., Judkewitz, B., Kano, M., Denk, W., Hausser, M. Targeted patch-clamp recordings and single-cell electroporation of unlabeled neurons in vivo. Nat. Methods. 5, 61-67 (2008).
  18. Pohl-Guimaraes, F., Krahe, T. E., Medina, A. E. Early valproic acid exposure alters functional organization in the primary visual cortex. Exp. Neurol. 228, 138-148 (2011).
  19. Bock, D. D., et al. Network anatomy and in vivo physiology of visual cortical neurons. Nature. 471, 177-182 (2011).
  20. Rochefort, N. L., et al. Development of direction selectivity in mouse cortical neurons. Neuron. 71, 425-432 (2011).
  21. Mrsic-Flogel, T. D., et al. Homeostatic regulation of eye-specific responses in visual cortex during ocular dominance plasticity. Neuron. 54, 961-972 (2007).
  22. Bonhoeffer, T., Grinvald, A., Toga, A. W., Mazziotta, J. C. Optical Imaging Based on Intrinsic Signals. Brain mapping: The Methods. , 55-97 (1996).
  23. Kerr, J. N., Greenberg, D., Helmchen, F. Imaging input and output of neocortical networks in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 14063-14068 (2005).
  24. Hofer, S. B., et al. Differential connectivity and response dynamics of excitatory and inhibitory neurons in visual cortex. Nat. Neurosci. 14, 1045-1052 (2011).

Play Video

Cite This Article
O’Herron, P., Shen, Z., Lu, Z., Schramm, A. E., Levy, M., Kara, P. Targeted Labeling of Neurons in a Specific Functional Micro-domain of the Neocortex by Combining Intrinsic Signal and Two-photon Imaging. J. Vis. Exp. (70), e50025, doi:10.3791/50025 (2012).

View Video