Summary

İzole kardiyomiyositlerin Hücresel Fonksiyon üzerine Antikor Etkilerinin Ölçümü

Published: March 08, 2013
doi:

Summary

Sunulan yöntem izole sıçan kardiyomiyositlerde hücresel kısalma ve hücre içi kalsiyum geçici üzerinde izole hasta immunglobulin etkisini analiz ederek, bağımsız spesifik antijen, dilate kardiyomiyopatili hastaların plazmasında fonksiyonel etkin cardiotropic otoantikor saptamak için bir yol sunar.

Abstract

Dilate kardiyomiyopati (DKMP) genç yetişkinler 1 kalp yetmezliği için ana nedenlerinden biridir. Toksik maddelere genetik eğilim ve fuar hastaların yaklaşık üçte birinde bu hastalığın nedenleri bilinmesine rağmen, DCM kökeni büyük ölçüde belirsizdir. Bu hastaların önemli bir kısmında, kardiyak epitoplara otoantikorların tespit edilmiş ve hastalığın 2,3 başlangıcı ve ilerlemesinde önemli bir rol oynadığından şüphe edilir. Kardiyak otoantikorların önemi immunoadsorbsiyon 3-5 ile otoantikorların ortadan kaldırıldıktan sonra DCM hastada hemodinamik iyileşme altı çizilir. Spesifik antijenlerin çeşitli zaten 2,3 tespit edilmiştir ve bu hedeflere karşı antikorlar immunoassay ile tespit edilebilir. Bununla birlikte, bu ölçümlerin uyarıcı (ve bu nedenle de fonksiyonel olarak etkin) ile bloke edici antikorlar arasında ayırt edemez. Eviden vardır artmaktadırBu ayrım önemlidir 6,7 olduğunu ce. Aynı zamanda, cardiotropic antikorların bir dizi hedeflerin yine tanımlanamayan ve bu nedenle bağışıklık deneyleri ile tespit edilemez olduğu kabul edilebilir. Bu nedenle, kendi antijeninin bağımsız işlevsel olarak aktif cardiotropic antikor tespiti için bir metod kurulmamıştır. Yöntem için arka plan genellikle memeli 8,9 arasında kardiyak proteinlerin işlevsel bölgeleri için gözlenen yüksek bir homoloji olduğu. Bu insan antijenlerine karşı, kardiyak antikorlar erişkin sıçan kardiyomiyositler üzerine DCM hastaların IgG test veriyor insan olmayan hedef hücreleri, ile çapraz reaksiyona girer göstermektedir. Önerilen yöntem, 3 adımlardan oluşur: ilk olarak, IgG immunoadsorbsiyon sütunlar (PlasmaSelect, Teterow, Almanya) dan elde edilen Sepharose birleştirilmiş anti-IgG antikorları kullanılarak hasta plazmadan izole edilir. İkinci olarak, erişkin kardiyomiyositlerde ap kullanılarak bir Langendorff perfüzyon cihaz içinde kolajenaz perfüzyon yoluyla izole edilirotokol önceki eserlerinden 10,11 güncellenmiştir. Elde edilen kardiyomiyositlerde laminin kaplanmış odacıklı coverglasses eklenmiş ve Fura-2, kolaylıkla (Ca 2 +) içindekiler 12 hücre içi kalsiyum gözlemlemek için hücre içine getirilebilir bir kalsiyum-seçici floresan boya ile boyanır. Son aşamada, hücre katı ve Ca 2 hasta IgG etki + alan uyarılan kardiyomiyositlerde geçici bir standart ters floresan bağlı olan bir ticari miyosit kalsiyum ve kasılmasını kontrol sisteminin (IonOptix, Milton, MA, ABD) kullanılarak online olarak izlenir mikroskop.

Protocol

1. Hasta Örneklerden IgG İzolasyonu Boş Econo Pac sütuna 2 ml hastanın EDTA plazma başına 3 ml anti-IgG Sepharose doldurarak mini immunoadsorbsiyon sütunlar hazırlayın. IgG izolasyon hastanın plazma, en az 2 ml gerektirir. Anti-IgG Sepharose üstünde filtre yerleştirin, sütunun alt ucu açık kesilmiş ve yaklaşık olarak 1 damla / sn 'lik bir akış hızına ulaşmak için filtre düğmesine basın. Sütunun tükendi korunması çözümü olsun. 3 cilt plazma hacmi baş…

Representative Results

Alanda hücresel inotropiyi ölçümü için iki örnek aşağıda verilmektedir, bir miyosit Ca 2 + ve kasılma kayıt sistemi kullanılarak erişkin kardiyomiyositlerde (Şekil 2) ile alınabilir. Şekil 3, bir kontrol ölçümü arasında bir izlenimini vermektedir, Şekil 4 içinde iken cardiodepressive antikorların etkisi bir hastanın DCM gösterilmiştir. Her iki örnek, başlangıç ​​hücre kısalma ve Ca 2 +</s…

Discussion

Sunulan yöntem belirsiz kökenli DCM hastalarda fonksiyonel olarak etkili kardiyak otoantikor saptamak için uygun bir yol sunar. Diğer yöntemler ile karşılaştırıldığında, cAMP seviyelerini 6 üzerindeki etkileri ile β1-adrenoseptör karşı işlevsel aktif antikorların saptanması, örneğin, bizim yöntem, belirli bir epitopa bağımsızdır. Tabii ki literatürde açıklanan diğer epitop bağımsız analizi yani yama klemp tekniği veya izole Purkinje lifleri 14 k…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Kardiyovasküler Hastalıklarda Humoral Bağışıklık Yanıtları (- Bu çalışma Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) ve Sonderforschungsbereich Transregio 19 (SFB/TR19, C2), Ekonomi ve Teknoloji proje ZIM-KF 2727801MD0 Federal Bakanlığı ve İnovasyon Yetkinlik Merkezi tarafından desteklenen ZIK-Yürüyüş, Eğitim ve Araştırma, Almanya Federal Bakanlığı BMBF FKZ 03Z2CN12). Hayvanlarla Konut ve deneyler Avrupa Laboratuar Hayvan Bilimi Derneği (FELASA) Laboratuvarı Zootekni (Gesellschaft für Versuchstierkunde, GV-SOLAS) ve Federasyon için Derneği'nin önerilerine göre yapıldı.

Materials

Name of the reagent/equipment Company Catalogue number Comments
Immunosorba preservation solution Fresenius Medical Care 903609211
Collagenase type 2 Cell System LS004176
BSA, fatty acid free Sigma-Aldrich A6003
Laminin Sigma-Aldrich L2020
Fura-2 AM Sigma-Aldrich F0888 1 mg/ml in DMSO
Econo Pac Chromatography Columns BioRad 732-1010
Spectra/Por Biotech Cellulose Ester Dialysis Membrane Spectrumlabs 131417
4 well Chambered Coverglass Nunc 155383
Myocyte Calcium and Contractility Recording System IonOptix
IonWizard 6.0 analysis software IonOptix

References

  1. Roger, V. L., et al. Heart disease and stroke statistics–2011 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 123 (4), e18 (2011).
  2. Caforio, A. L., Vinci, A., Iliceto, S. Anti-heart autoantibodies in familial dilated cardiomyopathy. Autoimmunity. 41 (6), 462 (2008).
  3. Yoshikawa, T., Baba, A., Nagatomo, Y. Autoimmune mechanisms underlying dilated cardiomyopathy. Circ. J. 73 (4), 602 (2009).
  4. Felix, S. B., et al. Hemodynamic effects of immunoadsorption and subsequent immunoglobulin substitution in dilated cardiomyopathy: Three-month results from a randomized study. Journal of the American College of Cardiology. 35 (6), 1590 (2000).
  5. Staudt, A., et al. Role of immunoglobulin G3 subclass in dilated cardiomyopathy: results from protein A immunoadsorption. Am. Heart J. 150 (4), 729 (2005).
  6. Nikolaev, V. O., et al. A novel fluorescence method for the rapid detection of functional beta1-adrenergic receptor autoantibodies in heart failure. J. Am. Coll. Cardiol. 50 (5), 423 (2007).
  7. Jahns, R., et al. Autoantibodies activating human beta1-adrenergic receptors are associated with reduced cardiac function in chronic heart failure. Circulation. 99 (5), 649 (1999).
  8. Gocayne, J., et al. Primary structure of rat cardiac beta-adrenergic and muscarinic cholinergic receptors obtained by automated DNA sequence analysis: further evidence for a multigene family. Proceedings of the National Academy of Sciences. 84 (23), 8296 (1987).
  9. Jaenicke, T., et al. The complete sequence of the human beta-myosin heavy chain gene and a comparative analysis of its product. Genomics. 8 (2), 194 (1990).
  10. Piper, H. M., Volz, A., Schwartz, P., Piper, H. M. . Cell Culture Techniques in Heart and Vessel Research. , (1990).
  11. Kubin, T., et al. Microvascular endothelial cells remodel cultured adult cardiomyocytes and increase their survival. Am. J. Physiol. 276 (6 Pt. 2), H2179 (1999).
  12. Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J. Biol. Chem. 260 (6), 3440 (1985).
  13. Magnusson, Y., et al. Autoimmunity in idiopathic dilated cardiomyopathy. Characterization of antibodies against the beta 1-adrenoceptor with positive chronotropic effect. Circulation. 89 (6), 2760 (1994).
  14. Wakefield, I. D., et al. The application of in vitro methods to safety pharmacology. Fundam. Clin. Pharmacol. 16 (3), 209 (2002).
  15. Kajzar, A., et al. Toward physiological conditions for cell analyses: forces of heart muscle cells suspended between elastic micropillars. Biophys. J. 94 (5), 1854 (2008).

Play Video

Cite This Article
Eckerle, L. G., Felix, S. B., Herda, L. R. Measurement of Antibody Effects on Cellular Function of Isolated Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (73), e4237, doi:10.3791/4237 (2013).

View Video