Summary

מדידה של אפקטי נוגדנים על תפקוד תאי של cardiomyocytes המבודד

Published: March 08, 2013
doi:

Summary

השיטה הוצגה מציעה דרך לזהות נוגדנים עצמיים cardiotropic יעילים פונקציונליים בפלזמה של חולים עם קרדיומיופתיה המורחבת, ללא קשר לאנטיגן הספציפי, על ידי ניתוח ההשפעה של אימונוגלובולין חולה המבודד בקיצור הסלולר וארעי סידן תאי בcardiomyocytes חולדה המבודדת.

Abstract

קרדיומיופתיה המורחבת (DCM) היא האחד הגורמים העיקריים לאי ספיקת לב במבוגרים הצעירים 1. למרות נטייה גנטית וחשיפה לחומרים רעילים ידועות סיבות למחלה זו כבשליש מהחולים, מקורו של DCM נותר במידה רבה בלתי ברור. במספר לא מבוטל של חולים אלה, נוגדנים העצמיים נגד אפיטופים לב שכבר זוהה וחשודים לשחק תפקיד מרכזי בתחילת ההתקדמות של המחלה 2,3. החשיבות של נוגדנים עצמיים לב מודגשת על ידי שיפור המודינאמית נצפה בחולי DCM נטרול נוגדנים עצמיים על ידי immunoadsorption 3-5. מגוון רחב של אנטיגנים ספציפיים כבר זוהה 2,3 ונוגדנים נגד יעדים אלה עשויים להיות מזוהים על ידי immunoassays. עם זאת, המבחנים הללו אינם יכולים להבחין בין הגירוי (ולכן פונקציונליים יעיל) וחסימת נוגדנים עצמיים. יש גובר evidence כי הבחנה זו היא חיוני 6,7. כמו כן, ניתן להניח כי היעדים למספר נוגדני cardiotropic עדיין לא מזוהים ולכן אינו ניתן לגילוי על ידי immunoassays. לכן, הקים שיטה לגילוי נוגדנים תפקודיים פעילים cardiotropic, עצמאיים של אנטיגן החוקי. הרקע לשיטה הוא ההומולוגיה הגבוהה בדרך כלל נצפתה לאזורים פעילים של חלבונים בלב בין יונקים 8,9. הדבר מצביע על כך נוגדני לב הופנו נגד אנטיגנים אנושיים יחצו-מגיבים עם תאי המטרה שאינם בני אדם, המאפשרים בדיקה של נוגדנים מחולי DCM על cardiomyocytes חולדות בוגרות. השיטה שלנו כוללת 3 שלבים: הראשון, IgG מבודד מפלזמת מטופל באמצעות נוגדני sepharose מצמידים אנטי IgG מתקבלים מעמודות immunoadsorption (PlasmaSelect, Teterow, גרמניה). cardiomyocytes שנית, למבוגרים מבודדים על ידי זלוף collagenase במנגנון זלוף Langendorff באמצעות aprotocol שונה מעבודות הקודמות של 10,11. את cardiomyocytes מתקבל מצורפים לcoverglasses הקבורים laminin המצופה ומוכתם בFura-2, צבע פלואורסצנטי סידן סלקטיבית אשר יכולה להיות מובא בקלות לתוך התא כדי לבחון הסידן תוך תאי (Ca 2 +) תוכן 12. בשלב האחרון, ההשפעה של מטופל על IgG קיצור התא וCa 2 + ארעי של cardiomyocytes שדה מגורה מנוטר באופן מקוון באמצעות מערכת ניטור התכווצות (IonOptix, מילטון, מסצ'וסטס, ארה"ב) סיד myocyte מסחרי ומחובר לניאון הפוך סטנדרטי מיקרוסקופ.

Protocol

1. בידוד נוגדנים מדגימות מטופל הכן עמודות המיני immunoadsorption ידי מילוי 3 מ"ל אנטי IgG sepharose לכל 2 מיליליטר מטופל EDTA פלזמה לעמודה ריקה Econo פאק. IgG בידוד דורש לפחות 2 מ"ל של פלזמת חולה. הנח על גבי מס?…

Representative Results

שתי דוגמאות למדידת inotropy הסלולרי בתחום מגורה cardiomyocytes הבוגר (איור 2) באמצעות myocyte Ca + ומערכת הקלטת contractility 2 הם כדלקמן. איור 3 נותן רושם של מדידת שליטה, ואילו באיור 4 ההשפעה של נוגדני cardiodepressive של חולה עם DCM מוצג. <p class="jove_content" style=";text-al…

Discussion

השיטה הוצגה מציעה דרך מתאימה כדי לזהות נוגדנים עצמיים לבביים יעילים תפקודיים בחולים עם DCM ממוצא לא ברור. בהשוואה לשיטות אחרות, למשל זיהוי של נוגדנים פעילים נגד פונקציונליים β1-adrenoceptor לפי חשיבותם ברמות cAMP 6, השיטה שלנו אינה תלויה בepitope ספציפי. כמובן שיש מבחני…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי Sonderforschungsbereich Transregio 19 (SFB/TR19, C2) של Forschungsgemeinschaft דויטשה (DFG), המשרד הפדרלי לכלכלה וטכנולוגית פרויקט לצים-KF 2727801MD0 והמרכז לכשירות חדשנות – תגובות חיסוניות הומורלית במחל לב וכלי דם ( זיק בטרמפים, BMBF FKZ 03Z2CN12) של המשרד הפדרלי לחינוך ולמחקר, גרמניה. שיכון וניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להמלצות של החברה למעבדה בבעלי חי מדע (Gesellschaft für Versuchstierkunde, GV-SOLAS) והפדרציה של מעבדה אירופית למדע בעלי חיים אגודים (FELASA).

Materials

Name of the reagent/equipment Company Catalogue number Comments
Immunosorba preservation solution Fresenius Medical Care 903609211
Collagenase type 2 Cell System LS004176
BSA, fatty acid free Sigma-Aldrich A6003
Laminin Sigma-Aldrich L2020
Fura-2 AM Sigma-Aldrich F0888 1 mg/ml in DMSO
Econo Pac Chromatography Columns BioRad 732-1010
Spectra/Por Biotech Cellulose Ester Dialysis Membrane Spectrumlabs 131417
4 well Chambered Coverglass Nunc 155383
Myocyte Calcium and Contractility Recording System IonOptix
IonWizard 6.0 analysis software IonOptix

References

  1. Roger, V. L., et al. Heart disease and stroke statistics–2011 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 123 (4), e18 (2011).
  2. Caforio, A. L., Vinci, A., Iliceto, S. Anti-heart autoantibodies in familial dilated cardiomyopathy. Autoimmunity. 41 (6), 462 (2008).
  3. Yoshikawa, T., Baba, A., Nagatomo, Y. Autoimmune mechanisms underlying dilated cardiomyopathy. Circ. J. 73 (4), 602 (2009).
  4. Felix, S. B., et al. Hemodynamic effects of immunoadsorption and subsequent immunoglobulin substitution in dilated cardiomyopathy: Three-month results from a randomized study. Journal of the American College of Cardiology. 35 (6), 1590 (2000).
  5. Staudt, A., et al. Role of immunoglobulin G3 subclass in dilated cardiomyopathy: results from protein A immunoadsorption. Am. Heart J. 150 (4), 729 (2005).
  6. Nikolaev, V. O., et al. A novel fluorescence method for the rapid detection of functional beta1-adrenergic receptor autoantibodies in heart failure. J. Am. Coll. Cardiol. 50 (5), 423 (2007).
  7. Jahns, R., et al. Autoantibodies activating human beta1-adrenergic receptors are associated with reduced cardiac function in chronic heart failure. Circulation. 99 (5), 649 (1999).
  8. Gocayne, J., et al. Primary structure of rat cardiac beta-adrenergic and muscarinic cholinergic receptors obtained by automated DNA sequence analysis: further evidence for a multigene family. Proceedings of the National Academy of Sciences. 84 (23), 8296 (1987).
  9. Jaenicke, T., et al. The complete sequence of the human beta-myosin heavy chain gene and a comparative analysis of its product. Genomics. 8 (2), 194 (1990).
  10. Piper, H. M., Volz, A., Schwartz, P., Piper, H. M. . Cell Culture Techniques in Heart and Vessel Research. , (1990).
  11. Kubin, T., et al. Microvascular endothelial cells remodel cultured adult cardiomyocytes and increase their survival. Am. J. Physiol. 276 (6 Pt. 2), H2179 (1999).
  12. Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J. Biol. Chem. 260 (6), 3440 (1985).
  13. Magnusson, Y., et al. Autoimmunity in idiopathic dilated cardiomyopathy. Characterization of antibodies against the beta 1-adrenoceptor with positive chronotropic effect. Circulation. 89 (6), 2760 (1994).
  14. Wakefield, I. D., et al. The application of in vitro methods to safety pharmacology. Fundam. Clin. Pharmacol. 16 (3), 209 (2002).
  15. Kajzar, A., et al. Toward physiological conditions for cell analyses: forces of heart muscle cells suspended between elastic micropillars. Biophys. J. 94 (5), 1854 (2008).

Play Video

Cite This Article
Eckerle, L. G., Felix, S. B., Herda, L. R. Measurement of Antibody Effects on Cellular Function of Isolated Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (73), e4237, doi:10.3791/4237 (2013).

View Video