Mesure des effets sur la fonction cellulaire anticorps de cardiomyocytes isolés
Summary
La méthode présentée offre un moyen de détecter les anticorps fonctionnels efficaces cardiotropes dans le plasma des patients atteints de cardiomyopathie dilatée, indépendamment de l'antigène spécifique, en analysant l'impact de l'immunoglobuline patient isolé sur raccourcissement cellulaire et transitoires de calcium intracellulaire dans les cardiomyocytes isolés de rats.
Abstract
La cardiomyopathie dilatée (DCM) est l'une des principales causes de l'insuffisance cardiaque chez les jeunes adultes 1. Bien que la prédisposition génétique et l'exposition à des substances toxiques sont des causes connues de cette maladie chez environ un tiers des patients, l'origine de DCM reste largement incertain. Dans un nombre important de ces patients, des auto-anticorps dirigés contre les épitopes cardiaques ont été détectés et sont soupçonnés de jouer un rôle central dans l'apparition et la progression de la maladie 2,3. L'importance de l'auto-anticorps cardiaques est soulignée par une amélioration hémodynamique chez les patients DCM après élimination des auto-anticorps par immuno 3-5. Une variété d'antigènes spécifiques ont déjà été identifiés et 2,3 anticorps contre ces cibles peuvent être détectées par des dosages immunologiques. Toutefois, ces tests ne peuvent pas distinguer entre la stimulation (et donc fonctionnellement efficace) et le blocage auto-anticorps. Il est en augmentation evidenCE que cette distinction est cruciale 6,7. Il peut également supposer que les objectifs fixés pour un certain nombre d'anticorps cardiotropes sont encore non identifiés et ne peuvent donc pas être détectée par des dosages immunologiques. Par conséquent, nous avons établi une méthode pour la détection des anticorps fonctionnellement actifs cardiotropes, indépendamment de leur antigène respectif. Le contexte de la méthode est la forte homologie habituellement observée pour les régions fonctionnelles des protéines cardiaques chez les mammifères entre 8,9. Ceci suggère que les anticorps dirigés contre les antigènes cardiaques humaines réaction croisée avec les cellules cibles non humaines, ce qui permet des tests d'IgG de patients DCM sur les cardiomyocytes de rats adultes. Notre méthode se compose de 3 étapes: d'abord, l'IgG est isolée du plasma du patient à l'aide de sépharose couplées à des anticorps anti-IgG obtenues à partir des colonnes immunoadsorption (PlasmaSelect, Teterow, Allemagne). Deuxièmement, les cardiomyocytes adultes sont isolés par perfusion de collagénase dans un appareil de perfusion de Langendorff en utilisant aprotocole modifié à partir de travaux antérieurs 10,11. Les cardiomyocytes obtenus sont joints à la laminine revêtues de couvre-objets cloisonnées et colorées avec du Fura-2, un colorant fluorescent sélectif de calcium qui peut être facilement introduit dans la cellule d'observer calcium intracellulaire (Ca 2 +) contenu 12. Dans la dernière étape, l'effet du patient IgG sur le raccourcissement de la cellule et Ca 2 + transitoires de cardiomyocytes le terrain ont stimulé est suivi en ligne en utilisant un calcium du commerce des myocytes et système de surveillance de la contractilité (IonOptix, Milton, MA, USA) connecté à un fluorescent standard inverse microscope.
Protocol
Representative Results
Discussion
La méthode présentée offre un moyen approprié pour détecter fonctionnellement efficaces autoanticorps cardiaques chez les patients atteints de DCM d'origine incertaine. En comparaison à d'autres méthodes, par exemple la détection d'anticorps fonctionnels actifs contre la β1-adrénergiques par leur impact sur les taux d'AMPc 6, notre méthode est indépendante d'un épitope spécifique. Bien sûr, il existe d'autres épitopes essais indépendants décrits dans la…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le Transregio Sonderforschungsbereich 19 (SFB/TR19, C2) de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), le ministère fédéral de l'Économie et de la Technologie du projet ZIM-KF 2727801MD0 et le Centre de Compétence Innovation – réponses immunitaires humorales dans les maladies cardio-vasculaires ( ZIK-RANDONNÉE, BMBF FKZ 03Z2CN12) du Ministère fédéral de l'Education et de la Recherche, Allemagne. Logement et des expériences avec des animaux ont été effectuées en conformité avec les recommandations de la Société pour la science des animaux de laboratoire (Gesellschaft für Versuchstierkunde, GV-SOLAS) et la Fédération européenne des animaux de laboratoire Science Association (FELASA).
Materials
| Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comments |
| Immunosorba preservation solution | Fresenius Medical Care | 903609211 | |
| Collagenase type 2 | Cell System | LS004176 | |
| BSA, fatty acid free | Sigma-Aldrich | A6003 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Fura-2 AM | Sigma-Aldrich | F0888 | 1 mg/ml in DMSO |
| Econo Pac Chromatography Columns | BioRad | 732-1010 | |
| Spectra/Por Biotech Cellulose Ester Dialysis Membrane | Spectrumlabs | 131417 | |
| 4 well Chambered Coverglass | Nunc | 155383 | |
| Myocyte Calcium and Contractility Recording System | IonOptix | ||
| IonWizard 6.0 analysis software | IonOptix |
References
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