Summary

Depletion und Rekonstitution von Makrophagen in Mäuse

Published: August 01, 2012
doi:

Summary

Makrophagen spielen eine zentrale Rolle bei der Homöostase und Pathologie in vielen Geweben. Das Protokoll beschreibt hier vorgestellte Verfahren zur Abreicherung von Makrophagen<em> In-vivo-</em>, Ableiten polarisierte Makrophagen aus Knochenmarkaspirate und adoptiv Übertragung Makrophagen in Mäusen. Diese Techniken erlauben die Bestimmung der Rolle, die polarisierte Makrophagen spielen in Gesundheit und Krankheit.

Abstract

Makrophagen sind wichtige Akteure der angeborenen Immunantwort auf infektiöse Herausforderung oder Verletzungen, Initiierung der angeborenen Immunantwort und die Leitung der erworbenen Immunantwort. Macrophage Dysfunktion kann zu einer Unfähigkeit führen, um eine geeignete Immunantwort und als solche ist in vielen Krankheitsprozessen, einschließlich entzündlicher Darmerkrankungen beteiligt ist. Makrophagen zeigen polarisiert Phänotypen, die grob in zwei Kategorien unterteilt sind. Klassisch aktivierten Makrophagen, aktiviert durch Stimulation mit IFN-oder LPS, spielen eine wesentliche Rolle in Reaktion auf bakterielle Herausforderung während alternativ aktivierten Makrophagen, aktiviert durch IL-4 oder IL-13, in Schutt und Scavenging Gewebeumbildung teilnehmen und wurden in der Auflösung in Verbindung gebracht Phase der Entzündung. Während einer Entzündungsreaktion in vivo werden Makrophagen unter einem komplexen Gemisch von infiltrierenden Immunzellen und kann durch Verschärfung oder Resolvin Teilnahmeg Entzündung. Um die Rolle von Makrophagen in situ definiert in einem ganzen Tier-Modell ist es notwendig, die Wirkung der Erschöpfung Makrophagen aus dem komplexen Umgebung zu untersuchen. Um Fragen über die Rolle von Makrophagen-Phänotyp in situ fragen, können phänotypisch definierten polarisierte Makrophagen ex vivo abgeleitet werden, aus Knochenmarkaspirate und wieder hinzugefügt, um Mäuse, mit oder ohne vorherige Depletion von Makrophagen. In der hier dargestellten Protokoll Clodronat-haltigen Liposomen, gegen PBS injiziert Kontrollen wurden verwendet, um Kolon Makrophagen während Dextran Natriumsulfat (DSS)-induzierte Colitis bei Mäusen führen. Darüber hinaus wurden polarisierte Makrophagen ex vivo abgeleitet und in Mäusen durch intravenöse Injektion. Ein Vorbehalt bei diesem Ansatz ist, dass Clodronat-haltige Liposomen führen alle professionellen Phagozyten, einschließlich der beiden dendritischen Zellen und Makrophagen so zu gewährleisten, die Wirkung durch eine Verarmung zu beobachten ist Makrophagen-spezifische, Rekonstitution of Phänotyp durch adoptiven Transfer von Makrophagen erforderlich ist. Systemische Makrophagen-Depletion bei Mäusen auch durch Rückkreuzung Mäusen auf eine CD11b-DTR Hintergrund erreicht werden kann, ist das eine ausgezeichnete Ergänzung. Der Vorteil von Clodronat-haltigen Liposomen-vermittelte Abreicherung ist, dass es nicht erforderlich, die Zeit und Kosten bei Rückkreuzung Mäusen beteiligt und es kann in Mäusen verwendet, unabhängig von dem Hintergrund der Mäuse (C57BL / 6, BALB / c oder gemischte Hintergund ).

Protocol

1. Depleting Makrophagen mit Clodronat-haltige Liposomen Liposomen werden bei 4 ° C gelagert Zwei Stunden vor der Injektion, zu entfernen Clodronat-haltigen Liposomen, PBS-enthaltenden Liposomen oder sterilem PBS (Einspritzsteuerung) aus dem Kühlschrank, damit sie auf Raumtemperatur (18 ° C) zu gewöhnen. Kehren Sie die Röhrchen mit Liposomen 8-10 mal um eine gleichmäßige Verteilung vor dem Einlegen in 200 pl einer 1 ml Spritze zu gewährleisten. Befestigen Sie eine 26-Gauge-Nadel an die Spitz…

Discussion

Makrophagen sind Phagozyten, die eine wichtige Rolle im Immunsystem spielen. Sie sind verantwortlich für die Initiierung der angeborenen Immunantwort und die Leitung der erworbenen Immunantwort. Typischerweise werden klassisch aktivierten Makrophagen durch IFN oder LPS aktiviert und sind für die Beseitigung von Pathogenen und zum Montieren eines Entzündungsreaktion 1. Umgekehrt werden alternativ aktivierten Makrophagen durch IL-4 oder IL-13 aktiviert und spielen eine Rolle in Schutt und Scavenging Gewebeum…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch ein 'Grant in Aid of Research "von der Crohn-und Colitis Foundation of Kanada zu LMS, die von einer kanadischen Gesellschaft für Gastroenterologie / kanadische Verband der Gesundheitsforschung / Morbus Crohn und Colitis Foundation of Kanada New Investigator Award unterstützt wird unterstützt.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number
Clodronate-containing liposomes Clodronateliposomes.org  
PBS-containing liposomes Clodronateliposomes.org  
Sterile PBS pH7.4 Invitrogen 14190
IMDM Invitrogen 12440
Fetal Calf Serum (FCS) Invitrogen 12483
acetic acid BDH Aristar BDH3092-500MLP
Monothioglycerol (MTG) Sigma 96-275
Recombinant murine MCSF Stemcell Technologies 02951
Recombinant murine GM-CSF Stemcell Technologies 02935
Recombinant murine IL-3 Stemcell Technologies 02903
Recombinant murine IFNγ Stemcell Technologies 02746
Recombinant murine IL-4 Stemcell Technologies 02714
Cell Dissociation Buffer Invitrogen 13150-016
Rat anti-F4/80 Antibody AbD Serotec MCA497GA
Mouse anti-ArgI Antibody BD Transduction Laboratories 610708

Table 1. Specific reagents used in this protocol.

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Cite This Article
Weisser, S. B., van Rooijen, N., Sly, L. M. Depletion and Reconstitution of Macrophages in Mice. J. Vis. Exp. (66), e4105, doi:10.3791/4105 (2012).

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