Summary

La evaluación de la hipermutación somática en Ramos células B después de sobreexpresión o derribo de genes específicos

Published: November 01, 2011
doi:

Summary

Se describe cómo realizar las infecciones por retrovirus o lentivirus de la sobreexpresión o siRNA que contienen las construcciones en la línea de Ramos humanos de células B y la forma de medir la hipermutación somática en estas células.

Abstract

Las células B comienzan su vida con los anticuerpos de baja afinidad generado por V (D) J recombinación. Sin embargo, al detectar un patógeno, la variable (V) la región de una inmunoglobulina (Ig) del gen se encuentra mutado aproximadamente 100.000 veces más que el resto del genoma a través de hipermutación somática (SHM), resultando en una alta afinidad 1,2 anticuerpos. Además, la recombinación de cambio de clase (CSR) produce anticuerpos con diferentes funciones efectoras dependiendo del tipo de respuesta inmune que se necesita para un patógeno en particular. Tanto la RSE y SHM se inician por la citidina deaminasa inducida por activación (AID), que desamina residuos de citosina en el ADN para producir uracilos. Estos uracilos son procesados ​​por las formas propenso a errores de las vías de reparación, con el tiempo provocando mutaciones y recombinación 3.1.

Nuestra actual comprensión de los detalles moleculares de SHM y RSE provienen de una combinación de estudios en ratones, las células primarias, las líneas celulares, y el F-Cellexperimentos de REE. Modelos de ratones siguen siendo el estándar de oro con nocauts genética que muestra un papel crítico para la reparación de muchos factores (por ejemplo, Ung, MSH2, MSH6, Exo1, y de la polimerasa η) 4-10. Sin embargo, no todos los genes se prestan a los estudios de octavos de final. Por ejemplo, golpes de gracia de varios de doble filamento romper las proteínas de reparación son embrionariamente letal o poner en peligro el desarrollo de células B 14/11. Por otra parte, a veces la función específica de una proteína en SHM o CSR pueden estar enmascarados por más defectos global causado por el golpe de gracia. Además, puesto que los experimentos en ratones pueden ser largos, alterando la expresión de genes individuales en las líneas celulares se ha convertido en un primer paso cada vez más popular para la identificación y caracterización de genes candidatos 15-18.

Ramos – un linfoma de Burkitt línea celular que constitutivamente se somete a SHM – ha sido una popular línea celular modelo para estudiar SHM 18-24. Una de las ventajas de las células de Ramos es que tienen una semi-construido en práctica-Cuantitativa medida de SHM. Las células de tipo salvaje expresa IgM y, como recogen las mutaciones, algunas de las mutaciones eliminar la expresión de IgM. Por lo tanto, analizando la pérdida de IgM mediante el escaneo de células activadas por fluorescencia (FACS) proporciona una rápida lectura para el nivel de SHM. Una medición más cuantitativa de la SHM se puede obtener por secuenciación directa de los genes de anticuerpos.

Dado que las células Ramos son difíciles de transfectar, producimos derivados estables que han aumentado o reducido la expresión de un gen individual al infectar las células con las construcciones retrovirales o lentiviral que contienen un casete de sobreexpresión o una corta horquilla de ARN (siRNA), respectivamente. Aquí se describe la forma en que infectan a las células Ramos y luego utilizar estas células para investigar el papel de genes específicos en el SHM (Figura 1).

Protocol

1. Preparación de muestras y las células Realizar una preparación mediana escala de ADN (Midiprep) de la sobre-expresión o siRNA que contienen las construcciones y la retroviral vector pKat2 envases o embalajes de los vectores lentiviral pVSV-G, pMDLg / pRRE, y PRSV-Ap 25. Use 6 mg de ADN para construir cada uno y ya sea de 4 mg de pKat2 (para las infecciones por retrovirus) o 1,5 mg de ADN de cada uno de los pVSV-g, pMDLg / pRRE, y PRSV-Rev vectores de embalaje (para las infecciones por lentiv…

Discussion

Como se mencionó anteriormente, los modelos de líneas celulares para la diversificación de anticuerpos se han convertido en un popular punto de partida para identificar nuevas proteínas que influyen en los diferentes pasos en la diversificación de anticuerpos. En este trabajo presentamos un método para el uso de la infección viral a las proteínas ya sea derribo o sobre-expresan en los Ramos de células B línea y luego examinar el impacto en SHM.

Para estos estudios, que utilizan tan…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

El pMSCV-AID-I-Thy1.1 y pKat2 vectores eran una especie de regalo de la Dirección General de Schatz y el pVSV-G, PRSV Ap-, y pMDLg / pRRE vectores eran una especie de regalo de BR Cullen.

Materials

Suggested reagents – most of these may be substituted with similar products from other vendors.

Name of the reagent Company Catalogue number Comments
6-well clear TC-treated plates Corning 3516  
10 mL BD Luer-Loksyringes BD Medical 309604  
24-well clear TC-treated plates Corning 3526  
96-well clear flat bottom polystyrene TC-treated microplates Corning 3596  
100 mm TC-treated culture dishes Corning 430167  
Acrodisc syringe filters, 0.45 μm Pall Life Sciences 4604  
Agar Teknova A7777  
Agarose GeneMate E-3120-500  
Ampicillin Sigma A0166 100 mg/mL in water
BD FACSCanto II flow cytometer BD Biosciences   or similar
BD Falcon round bottom polystyrene tubes BD Biosciences 352054 for FACS
BOSC 23 cells ATCC CRL-11270  
CO2 incubator capable of 37°C      
DMEM (Dulbecco′s modified Eagle′s medium) Sigma D6429  
FBS (fetal bovine serum) Gemini Bio-Products 100-106  
FITC α-rat CD90/mouse CD90.1 antibody BioLegend 202503 FITC α-Thy1.1
FuGENE 6 Transfection Reagent Roche 11814443001  
HEPES buffer solution Invitrogen 15630-080  
KAPA HiFi DNA polymerase KAPA Biosystems KK2101  
LB Broth (lysogeny broth – Luria) Powder Difco 240230  
MISSION TRC shRNA bacterial glycerol stock Sigma   shRNA vectors
NCS (newborn calf serum) Gemini Bio-Products 100-504  
PBS (phosphate buffered solution) Invitrogen 70011 diluted to 1x in water
PE α-human IgM antibody BioLegend 314508  
PGS (penicillin-streptomycin-glutamine solution) Gemini Bio-Products 400-110  
Polybrene (hexadimethrine bromide) Sigma 107689 10 mg/mL in water
PureYield Plasmid Midiprep System Promega A2495  
Puromycin Sigma P8833 250 μg/mL in water
QIAquick gel extraction kit QIAGEN 28706  
Ramos (RA 1) cells ATCC CRL-1596  
RPMI-1640 medium Sigma R8758  
SuperScript II Invitrogen 18064-022  
SYBR FAST qPCR kit KAPA Biosystems KK4601  
Taq DNA Polymerase Invitrogen 18038-042  
TOPO TA Cloning kit Invitrogen K4520-01  
TRIzol Invitrogen 15596-026  
Wizard SV Genomic DNA purification system Promega A2361  
X-Gal [5-bromo-4-chloro-3-indoyl-β-D-galatopyranoside] Growcells C-5687 40 mg/mL in DMSO

References

  1. Di Noia, J. M., Neuberger, M. S. Molecular mechanisms of antibody somatic hypermutation. Annu. Rev. Biochem. 76, 1-22 (2007).
  2. Peled, J. U. The biochemistry of somatic hypermutation. Annu. Rev. Immunol. 26, 481-511 (2008).
  3. Longerich, S., Basu, U., Alt, F., Storb, U. AID in somatic hypermutation and class switch recombination. Curr. Opin. Immunol. 18, 164-174 (2006).
  4. Bardwell, P. D. Altered somatic hypermutation and reduced class-switch recombination in exonuclease 1-mutant mice. Nat. Immunol. 5, 224-229 (2004).
  5. Martomo, S. A., Yang, W. W., Gearhart, P. J. A role for Msh6 but not Msh3 in somatic hypermutation and class switch recombination. J. Exp. Med. 200, 61-68 (2004).
  6. Phung, Q. H. Increased hypermutation at G and C nucleotides in immunoglobulin variable genes from mice deficient in the MSH2 mismatch repair protein. J. Exp. Med. 187, 1745-1751 (1998).
  7. Rada, C., Ehrenstein, M. R., Neuberger, M. S., Milstein, C. Hot spot focusing of somatic hypermutation in MSH2-deficient mice suggests two stages of mutational targeting. Immunity. 9, 135-141 (1998).
  8. Rada, C. Immunoglobulin isotype switching is inhibited and somatic hypermutation perturbed in UNG-deficient mice. Curr. Biol. 12, 1748-1755 (2002).
  9. Delbos, F., Aoufouchi, S., Faili, A., Weill, J. C., Reynaud, C. A. DNA polymerase eta is the sole contributor of A/T modifications during immunoglobulin gene hypermutation in the mouse. J. Exp. Med. 204, 17-23 (2007).
  10. Masuda, K. DNA polymerase eta is a limiting factor for A:T mutations in Ig genes and contributes to antibody affinity maturation. Eur. J. Immunol. 38, 2796-2805 (2008).
  11. Lim, D. S., Hasty, P. A mutation in mouse rad51 results in an early embryonic lethal that is suppressed by a mutation in p53. Mol. Cell. Biol. 16, 7133-7143 (1996).
  12. Xiao, Y., Weaver, D. T. Conditional gene targeted deletion by Cre recombinase demonstrates the requirement for the double-strand break repair Mre11 protein in murine embryonic stem cells. Nucleic. Acids. Res. 25, 2985-2991 (1997).
  13. Zhu, J., Petersen, S., Tessarollo, L., Nussenzweig, A. Targeted disruption of the Nijmegen breakage syndrome gene NBS1 leads to early embryonic lethality in mice. Curr. Biol. 11, 105-109 (2001).
  14. Luo, G. Disruption of mRad50 causes embryonic stem cell lethality, abnormal embryonic development, and sensitivity to ionizing radiation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 7376-7381 (1999).
  15. Pavri, R. Activation-induced cytidine deaminase targets DNA at sites of RNA polymerase II stalling by interaction with Spt5. Cell. 143, 122-133 (2010).
  16. Lee-Theilen, M., Matthews, A. J., Kelly, D., Zheng, S., Chaudhuri, J. CtIP promotes microhomology-mediated alternative end joining during class-switch recombination. Nat. Struct. Mol. Biol. 18, 75-79 (2011).
  17. Basu, U. The RNA exosome targets the AID cytidine deaminase to both strands of transcribed duplex DNA substrates. Cell. 144, 353-363 (2011).
  18. Yabuki, M., Fujii, M. M., Maizels, N. The MRE11-RAD50-NBS1 complex accelerates somatic hypermutation and gene conversion of immunoglobulin variable regions. Nat. Immunol. 6, 730-736 (2005).
  19. Sale, J. E., Neuberger, M. S. TdT-accessible breaks are scattered over the immunoglobulin V domain in a constitutively hypermutating B cell line. Immunity. 9, 859-869 (1998).
  20. Cumbers, S. J. Generation and iterative affinity maturation of antibodies in vitro using hypermutating B-cell lines. Nat. Biotechnol. 20, 1129-1134 (2002).
  21. Papavasiliou, F. N., Schatz, D. G. Cell-cycle-regulated DNA double-stranded breaks in somatic hypermutation of immunoglobulin genes. Nature. 408, 216-221 (2000).
  22. Parsa, J. Y. AID mutates a non-immunoglobulin transgene independent of chromosomal position. Mol. Immunol. 44, 567-575 (2007).
  23. Zhang, W. Clonal instability of V region hypermutation in the Ramos Burkitt’s lymphoma cell line. Int. Immunol. 13, 1175-1184 (2001).
  24. Ukai, A. Induction of a:T mutations is dependent on cellular environment but independent of mutation frequency and target gene location. J. Immunol. 181, 7835-7842 (2008).
  25. Dull, T. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. J. Virol. 72, 8463-8471 (1998).
  26. Nakamura, M. High frequency class switching of an IgM+ B lymphoma clone CH12F3 to IgA+ cells. Int. Immunol. 8, 193-201 (1996).
  27. Muramatsu, M. Specific expression of activation-induced cytidine deaminase (AID), a novel member of the RNA-editing deaminase family in germinal center B cells. J. Biol. Chem. 274, 18470-18476 (1999).

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Cite This Article
Upton, D. C., Unniraman, S. Assessing Somatic Hypermutation in Ramos B Cells after Overexpression or Knockdown of Specific Genes. J. Vis. Exp. (57), e3573, doi:10.3791/3573 (2011).

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