We hebben een flowcytometer met behulp van laser-geïnduceerde echografie op te sporen circulerende melanoom cellen als een vroege indicator van gemetastaseerde ziekte.
Circulerende tumorcellen (CTC's) zijn de cellen die zijn gescheiden van een macroscopische tumor en de verspreiding door het bloed en de lymfe systemen om zaad secundaire tumoren 1,2,3. CTC zijn indicatoren van gemetastaseerde ziekte en hun detectie in bloedmonsters kunnen worden gebruikt om kanker te diagnosticeren en monitoren van een patiënt respons op therapie. Aangezien de CTC zijn zeldzaam, bestaande uit ongeveer een tumorcel te midden van miljarden van normale bloedcellen in gevorderde kankerpatiënten, hun opsporen en kwantificeren is een moeilijke taak. We gebruik maken van de aanwezigheid van pigment in de meeste melanoom cellen te genereren fotoakoestische of laser-geïnduceerde ultrasone golven in een aangepaste flowcytometer voor de detectie van circulerende melanoom cellen (CMC's) 4,5. Dit proces houdt in het scheiden van een volbloed monster met behulp van centrifugeren en het verkrijgen van de witte bloedcellen laag. Indien aanwezig in volbloed, zal CMC scheiden met de witte bloedcellen als gevolg van soortgelijke dichtheid. Deze cellen worden geresuspendeerd infosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en geïntroduceerd in de flowmeter. In plaats van een continue stroom van het bloed celsuspensie, we geïnduceerde twee fase stroming in om deze cellen te vast te leggen voor verdere studie. In twee fase stroming, twee niet-mengbare vloeistoffen in een microfluïdische systeem aan op een kruispunt en vormen afgewisseld slakken van vloeibare 6,7. PBS zwevende witte bloedcellen en de lucht vormen microliter slakken die opeenvolgend worden bestraald met laserlicht. De toevoeging van een oppervlakte-actieve stof van de vloeibare fase laat uniform slug vorming en de gebruiker kan verschillende afmetingen slakken te creëren door het veranderen van het debiet van de twee fasen. Slakken van lucht en naaktslakken van PBS met witte bloedcellen bevatten geen licht absorberen en dus, produceren geen fotoakoestische golven. Echter, naaktslakken van de witte bloedcellen die zelfs enkele CMC's bevatten absorberen laserlicht en produceren hoogfrequente geluidsgolven. Deze slakken die fotoakoestische golven te genereren worden afgezonderd en verzameld voor cytochemische kleuring voor verificatie van CMC's.
Het detecteren van CTC is nog steeds een onderzoek intensief gebied met zeer weinig klinische toepassingen te wijten aan het moeilijke probleem van het isoleren van de zeldzame tumor cellen. Veel andere technieken worden geëvalueerd voor CTC detectie, met inbegrip RT-PCR, microfluïdische cel vast te leggen, immunomagnetische vangen, en andere methoden 8-12. Echter, fotoakoestische detectie van CMC's toont belofte want het is vrij label en biedt een snelle en accurate manier om klein, licht absorberende deeltjes op te vangen.
Het protocol beschreven om witte bloedcellen te isoleren is zeer efficiënt, maar toch een laag aantal rode bloedcellen aanwezig in het monster. Deze rouge contaminerende cellen ook laserlicht te absorberen, maar op een sterk verminderd niveau. Om ervoor te zorgen de rode bloedcellen niet bemoeien met onze melanoom detectiesysteem, werden vijf gezonde patiënten monsters ingevoerd door het systeem en niemand gaf een signaal, wat aangeeft dat de rode bloedcellen aanwezig zijn bij lage concentraties voldoendebuiten beschouwing gelaten.
Een reeks van concentratie studies zijn uitgevoerd met behulp van gekweekte melanoomcellen en het fotoakoestische flow systeem is gevoelig tot 1 cel / ul (ongepubliceerde gegevens) bewezen. Deze studies zijn aan de gang en zal binnenkort onder meer proeven met kankerpatiënten monsters.
Dit fotoakoestische techniek wordt ook geëvalueerd voor gebruik in niet-gepigmenteerde CTC, zoals borst-en prostaatkanker door het aanbrengen van exogene chromoforen. Wij hebben voorbereidende werk met behulp van gouden nanodeeltjes op kanker cells13. Deze testen hebben aangetoond dat nanodeeltjes kunnen de nodige optische absorptie te verstrekken aan fotoakoestische golven te genereren. De resterende technische uitdaging is om dergelijke deeltjes selectief hechten aan kankercellen.
The authors have nothing to disclose.
Wij erkennen de steun van de Afdeling Biologische Engineering en de Christopher S. Bond Life Sciences Center van de Universiteit van Missouri. Wij erkennen subsidies uit Missouri Life Sciences Research Board 09-1034 en NIH R21CA139186-0. We danken ook de Life Sciences Undergraduate Research Opportunity Program aan de Universiteit van Missouri, de Universiteit van Missouri Moleculaire Cytologie Core, en de Universiteit van Missouri College of Engineering voor financiële steun.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
DMEM | Invitrogen | ABCD1234 |