カットローディング：網膜ニューロン間ギャップ結合トレーサーカップリングの程度を調べるための便利なツール

1。金魚、マウスおよびウサギの無傷の神経網膜の準備一定の周囲（背景）照明の下で説明されているものを含め、次の手順のすべて、"2）カットの読み込みを、"実行。このプロトコルの目的のために、手続きは（つまりは非常に暗い（つまり、"暗所視"）の条件で≤0.0001ルクス）をナイトビジョン赤外線ゴーグルを使用して一定の暗さにように行わ記述されているが、一定の周囲の照明の他の高強度レベルに注意してくださいギャップ結合のトレーサーのカップリングの周囲の照明の他のレベルの効果を決定する代わりに使用することができます。 手術の前に少なくとも1時間のための実験動物（金魚、マウスまたはウサギを）暗順応。 前述の7に記載、深くtricaineメタン（MS222;（炭酸水素ナトリウムを含む）バッファリング水槽の水の150 mg / L）をにそれらを置くことによって金魚を麻酔し、深くケタミン（100 mgとマウスを麻酔/ kgを、IP）とrompun（10 mg / kgを、IP）。深くウレタンでウサギを麻酔（負荷投与量：2.0 g / kgの、IP）とも地元の眼窩内の麻酔を（2％キシロカイン）を使用して、前述の8を説明。動物の管理と使用を含むすべての実験手順は、連邦政府のガイドラインに従って実施されるべきであると地元の大学の動物のケアと使用委員会によって審査され承認される。 （注：実験では魚、マウスやウサギの世話及び使用に伴うすべての実験手順は、NIHのガイドラインに沿って行われたとオハイオ州立大学動物実験および使用委員会によって審査され承認された、ここで説明。） 魚、マウスやウサギの場合は、摘出後に、各眼球の前方部分を削除してください。その後、ろ紙の目の後部の下になるように、眼の後部の上にろ紙片を置き、ろ紙と目を反転させる。その後、細かい使用して鉗子は、そっとろ紙に接続されている神経網膜、から、お互いに接続されている色素上皮/脈絡膜/強膜を、はげることによって眼の後部から無傷の神経網膜を細かく分析。これが行われているように、微細なバネ付きはさみを使用して視神経を切断。神経網膜、指向光受容体サイドアップは、現在、ろ紙に取り付けられており、目の残りの部分から分離する必要があります。 2。カットローディングある一定の周囲（背景）イルミネーション（非常に暗い（つまり、"暗所視"）の条件の下など）の下で30分間、6ウェルプレート（〜5 mLの/ウェル）の有無に関係なく酸素化リンガー溶液（ 表1）の水没は、網膜被験薬。パラフィルムで6ウェルプレートを封止することによって重炭酸塩ベース（5％CO 2 / 95％O 2）酸素リンゲル22℃での魚の網膜を維持し、36で、マウスとウサギ網膜を維持℃、5％CO 2 /のCを95％O <suB> 2インキュベーター。被験薬が使用されている場合、それは固定するまで、後続のすべてのステップの間に存在する必要があります網膜を切開する直前に、リンゲル溶液でneurobiotin（0.5％）、ビオチン化分子を、溶解してトレーサー液を（通常は100μL）を用意。 0.5パーセントは、ローダミンデキストランが（高い（> 10,000）MW）ソリューションに追加される可能性があることに注意してください。その高分子量のために、ローダミンデキストランは、ギャップ結合とカットによって損傷されているラベルだけのセルを越えることはありません。 図に示す。 3、これは彼らが負傷されているので、ギャップ結合を介して拡散によりトレーサーを蓄積してきたものから、neurobiotin蓄積して細胞を区別する便利な方法です。 ガラス（またはプラスチック）ペトリ皿にneurobiotinソリューションを配置する、、過剰リンガーを削除neurobiotinソリューションで、かみそりの刃を（または他の鋭利な刃）ディップとするペーパータオルの上に網膜が添付されている濾紙を、、タップ市販nは、網膜と濾紙でラジアルカットを行います。優先の場合、スペーサはそのカットが網膜を介して行われていることではなく、濾紙を使用することができます。カットは、網膜表面に垂直に配向してください。再びneurobiotinのソリューションで、かみそりの刃を浸して網膜をもう一度カット。網膜ごとに4カット（ 図1参照 ）にこの設定を繰り返します。マウスや他の小さな網膜を通してかみそりの削減を行うときに解剖顕微鏡を使用してください。 図に示す。被験薬の有無にかかわらず1、新鮮なリンゲル培地で再び水没網膜を、、（5mLのリンゲル/ウェル）ウェル6プレートを使用して。ローディングと拡散を可能にするために15分間網膜をインキュベートする。 被験薬の有無に関係なく新鮮なリンゲル培地で5分間ずつ3回洗浄する。 室温で1時間、0.1 Mリン酸緩衝液（PBS、pH7.4）中4％パラホルムアルデヒドで網膜を修正。 一晩4 0.1 M PBSで洗浄℃に翌日、反応させるワットi番目の百分の二0.1M PBSでストレプトアビジン-アレクサ488（最終濃度10μg/ mLの）+ 0.3％トリトンX – 100、および4℃で一晩おく℃に室温で10分0.1M PBSで各3回洗浄し PBS中で、微細なブラシを使用して、次にろ紙から網膜をデタッチし、スライドの上に、網膜、指向光受容側の上に置きます。 優しくVectashieldマウンティング培地（ベクターラボラトリーズ社、バーリンゲーム、カリフォルニア州）でマウントされます。 の範囲で、別の実験条件（照明条件などの試験薬）の効果を比較できるように、すべての実験条件で同じ倍率、解像度と設定で共焦点顕微鏡（例えばツァイス510 META）をスキャンするレーザーを使用して撮影をするギャップジャンクショントレーサー結合した（ 図2A – C及び図4A – C）。単一のイメージが標識された細胞のすべてが含まれることもありますが、それはあなたが興味のある領域のz -スタックを収集し、単一にそれを折りたたむことをお勧めしますイメージ。 3。 ImageJを用いてトレーサー結合の定量化 LSMの画像ブラウザで、画像を開いて、TIF – 16ビットの圧縮されないファイルとしてエクスポート]をクリックして画像を保存します。スケールバーは、このTIF画像に含まれるべきです。 NIH ImageJのソフトウェアを使用して、ホールマウント網膜の低倍率像からのAlexa – 488標識neurobiotinの蛍光強度を測定する。 ImageJのソフトウェアを使用してTIFファイルを開き、[スケールバーに対応する直線を引く。スケールを設定し、長さの既知の距離と単位を入力し、解析を行うに移動し、[OK]をクリックします。今すぐ測定結果は、ミリメートルキャリブレーション単位で表示することができます。 長方形選択ツールを使用して、関心の領域を選択します。蛍光のピークは、選択枠の左側に配置する必要があります。右の境界付近には蛍光シグナルがないことを確認してください。されていない場合は、アクティブな画像（IMAGE、頭を矢印）を回転させる。 クリックして分析し、PROFILEをプロットします。あなたは左から右に指数関数的減衰を持つカーブが表示されるはずです。 ポップアップウィンドウでCOPYをクリックし、EXCELに貼り付けます。これではカット（左列）とカット（右列）からの距離の関数として蛍光強度から距離を示す二つの列を参照してください。 相対蛍光強度を得るために最大蛍光値によって各生の蛍光値を割ります。 [コピー]は、2つのカット（X）と相対蛍光強度（Y）からの距離に対応する列、およびOriginソフトウェアに貼り付ける。 指数減衰形になっている＃1関数（。図2D及び図4D）、とのはめあい。 Y = Y 0 + Y 最大 * EXP（- X /λ） Yは相対蛍光強度である場合、Y oはバックグラウンドの蛍光であり、Y maxは最大相対蛍光であり、λはspです。エース（長さ）定数、xはカットからの距離です。 t検定またはANOVAを（ 図2E及び図4E）を使用して、異なる実験条件で空間定数（λ）の値を比較します。定量化の代替技術が他人13,14によって記述されていることに注意してください。 4。代表的な結果カットロードによって決定されるカップリング光受容体細胞トレーサーの代表的な例は、 図2及び図3（魚）と図4（ウサギ）で表示されます。共焦点画像は、比較のために、同じ設定を使用して撮影した（ 図2A – C及び図4A – C）と蛍光強度がカットからの距離の関数としてプロットし、上記の3.8号に示すように指数関数でフィッティングした（ 図2D及び図4D）。各条件のためのスペースの定数値ギャップ結合トレーサーの結合の程度がカットローディングテクニックを使用して定量することができること示す、2Eと4E図に示されています。さらに、結果は高い再現性です。ギャップ結合トレーサーの結合の程度を定量化する手段として、カットローディングテクニックの使用はまた、蛍光強度はすべてのケースでカットからの距離の関数として指数関数的に減少することを見つけることによって検証されること（また、 図を参照してください。7,8の検討neurobiotinは、他の網膜のサイトからレザーカットではなく、経由して光受容体に入ったことを示すここで2Dと4D）、。また、光受容体細胞トレーサーのカップリングで質的に類似昼/夜の違いは、シングルコーンにトレーサーの注射と金魚とカットローディング7で観察光受容体の結合の程度を測定するのが比較的正確な手段として、カットローディングを立証する。 カット- Loading技術はまた、網膜で電気シナプスの他のタイプを調査するために使用することができます。例えば、 図 5は、そのウサギ型（ 図5A）およびB型（ 図5B）水平細胞を示して暗順応条件下でneurobiotinの以下のカットローディングと拡散を結合相同トレーサーを示す。 化合 魚 マウス ウサギ NaClを 130 120 117 飽和NaHCO 3 20 25 30 のNaH 2 PO 4 – 1 0.5 KCL 2.5 5 3.1 グルコース 10 10 10 MgCl 2の 1 – – し、MgSO 4 · 7H 2 O – 1 1.2 グルタミン – 0.1 0.1 CaCl 2で 0.7 2 2 表1：金魚、マウスおよびウサギ網膜のためのリンガーのソリューションの構成。濃度は、mm単位で表示されます。リンガーのソリューションは、5％CO 2 / 95％O 2でバブリングし、22 ° C（魚）または36 ° C（哺乳類）に維持されています。 " – "：この種のためのリンガーに含まれていない。 図1：。カットローディング手順を示すフローチャート。分離O後fは無傷の神経網膜は、いくつかの半径方向のカットは、最初に0.5％neurobiotin溶液に浸漬したブレードによってなされた。網膜は、トレーサーのローディングと拡散インキュベートし、0.1Mリン酸緩衝液（PB）の4％パラホルムアルデヒド（PFA）で固定する前に洗浄した。トレーサーカップリングはAlexa – 488ストレプトアビジンコンジュゲートを使用して検討した。 図2：金魚の光受容体トレーサー結合における昼夜の違いは、カットローディング手法によって明らかにされます。光受容体細胞のギャップジャンクションneurobiotinトレーサーの結合は、制御の条件（）で夜間（B）でとペロンの日の次のアプリケーション（10μM）、選択的ドーパミンD 2受容体拮抗剤（C）ではなく、一日で広範囲だ。カット（ACの矢印で示した部分）からの距離の関数としてD）正規化された相対蛍光強度。 E）スペース定数valはDと他の実験（n = 4）のデータから得られたUES。 *** P <0.001。 図3。neurobiotinとローダミンデキストランの両方のソリューションでカットのロードを以下の夜間暗順応金魚の網膜の光受容体細胞層に蛍光を示す代表的な例。その高分子量（> 10,000 MW）、カットの近くにのみ標識された細胞によるオープンギャップ結合チャネルを介して拡散しないローダミンデキストラン（赤で表示）、。対照的に、ギャップ結合を介して拡散neurobiotin（緑で表示）とは、遠くのカットから視細胞で見ることができます。カットの位置は、各パネルの矢印で示されます。スケールバー：200μmの。 図4。昼夜異なるウサギの網膜で結合光受容体トレーサーのリファレンスがカットローディング手法によって明らかにされます。光受容体細胞のギャップジャンクショ​​ンneurobiotinトレーサーの結合は、制御の条件（）で一日ではないスピペロン（10μM）（C）のアプリケーションは、次の夜（B）で、日中の豊富なだったが、。 ACで、カットの近くにウサギの光受容体の3次元再構成の垂直のビューが表示されます。カットからの距離の関数としてD）正規化された相対蛍光強度。 E）Dと他の実験（n = 3）のデータから得られた空間の定数値は、。 *** P <0.001。 図5。カットローディングは、暗順応ウサギ水平細胞はトレーサーが結合されていることを明らかにする。型（）とB型の両方（B）暗順応ウサギの網膜の水平細胞は、相同neurobiotinトレーサーの結合を示した。