Summary

Durchflusszytometrie-Analyse von Immunzellen innerhalb Murine Aorten

Published: July 01, 2011
doi:

Summary

Dieser Beitrag stellt eine Durchflusszytometrie-basierte Methode, um das Immunsystem Zusammensetzung der Aorta zu untersuchen. Das Papier zeigt auch eine weitere Technik, die Prüfung umgebenden Adventitia und Gefäßwand getrennt werden können. Diese Methode eröffnet Möglichkeiten, um phänotypische Analysen der Aorta Leukozyten führen und in mehreren immunologischen Assays für die Atherosklerose-Studien.

Abstract

Atherosklerose ist eine chronisch entzündliche Prozess der mittelgroßen und großen Schiffen, die durch die Bildung von Plaques, bestehend aus Schaumstoff, Immunzellen, vaskuläre Endothel-und glatten Muskelzellen, Thrombozyten, extrazelluläre Matrix und einer Lipid-reichen Kern mit ausgedehnter Nekrose gekennzeichnet ist und Fibrose des umgebenden Gewebes. 1 Die angeborene und adaptive Arme der Immunantwort bei der Initiierung, Entwicklung und Persistenz von Atherosklerose beteiligt. 2, 3 gibt es eine beträchtliche Menge Beweise dafür, dass verschiedene Untergruppen der Immunzellen, wie Makrophagen, dendritische Zellen, T-und B-Lymphozyten sind innerhalb des Aorten von gesunden und Arteriosklerose anfällig Mäusen 4. Darüber hinaus sind Immunzellen in das umgebende Aorten-Adventitia, die eine wichtige Rolle dieses Gewebes schlägt in der Atherogenese gefunden. 2

Für einige Zeit war die quantitative Bestimmung der verschiedenen Arten von Immunzellen, deren Aktivierung den Status und die zelluläre Zusammensetzung innerhalb der Aortenwand durch RT-PCR und immunhistochemische Methoden zur Untersuchung der Atherosklerose beschränkt. Nur wenige wurden Versuche unternommen, die Durchflusszytometrie mit menschlichen Aorten durchzuführen, und eine Reihe von Problemen, wie zum Beispiel eine hohe Autofluoreszenz, berichtet worden 5,6. Humanen atherosklerotischen Plaques wurden mit Collagenase 1 verdaut und freie Zellen wurden gesammelt und für CD14 gefärbten + / CD11c + zu Makrophagen-abgeleitete Schaumzellen Highlight. In dieser Studie wurde ein "Mock"-Kanal verwendet werden, um falsch-positive Färbung zu vermeiden. 6 Necrotic Materialien sammeln während des Aufschlusses entstehen in einer großen Menge von Trümmern, die eine hohe Autofluoreszenz in der Aorta Proben erzeugt. Um dieses Problem zu lösen, hat ein Gremium von negativen und positiven Kontrollen vorgeschlagen worden, aber nur Doppelfärbung konnte in diesen Proben angewendet werden. Wir haben eine neue Basis der Durchflusszytometrie-Methode 7 an die Immunzellen Zusammensetzung zu analysieren und zu charakterisieren, die Aktivierung, Proliferation, Differenzierung von Immunzellen bei gesunden und Arteriosklerose anfällig Aorta entwickelt. Diese Methode erlaubt die Untersuchung der Immunzellen Zusammensetzung der Aortenwand und öffnet Möglichkeiten für ein breites Spektrum von immunologischen Methoden zur Untersuchung des Immunsystems Aspekte dieser Krankheit verwendet werden.

Protocol

1. Isolierung von murinen Aorten Institutionelle IACUC Ausschuss Zulassung des Verfahrens ist erforderlich, um mit Mäusen arbeiten. Bereiten heparinzed PBS durch Zugabe von 1000 Einheiten Heparin-Natrium und 50 ml PBS und Umdrehen des Röhrchens mischen. Bereiten Sie eine leere Auflistung Rohr für das Blut und eine Sammlung Röhrchen mit PBS für jeden Aorta gesammelt werden. Bewahren Sie alle Röhrchen auf Eis. Heparinisierung eine Spritze zur Blutabnahme (0,1 von 100…

Discussion

Hier präsentieren wir eine Durchflusszytometrie-basierte Methode für die Untersuchung der Immunzellen Zusammensetzung der murine Aorten. Der große Vorteil dieser Methode ist die Möglichkeit, Aorten-Immunzellen bei einer einzigen Zelle Ebenen zu analysieren und die Aktivierung Status der Aorta Leukozyten charakterisiert. Diese Methode ist nicht auf murine Aorten beschränkt und wir (unveröffentlichte Daten) und andere 10 verwendet diesen Ansatz für die menschliche Präparate wie z. B. Arteria mammaria, A…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

PO1 HL55798 (bis KL) und American Heart Association Scientist Development Grant 0525532U (zum EG): Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health gewähren unterstützt.

Materials

Material Catalog Number Company
Collagenase XI C7657 Sigma-Aldrich
Hyaluronidase H3506 Sigma-Aldrich
DNase I, type 2 D4527 Sigma-Aldrich
Collagenase I C0130 Sigma-Aldrich
Collagenase II LS004174 Worthington Biochemical Corporation
Elastase LS002292 Worthington Biochemical Corporation

References

  1. Lusis, A. J. Atherosclerosis. Nature. 407, 233-2341 (2000).
  2. Galkina, E., Ley, K. Immune and inflammatory mechanisms of atherosclerosis. Annu Rev Immunol. 27, 165-197 (2009).
  3. Hansson, G. K., Libby, P. The immune response in atherosclerosis: a double-edged sword. Nat Rev Immunol. 6, 508-519 (2006).
  4. Galkina, E., Ley, K. Leukocyte influx in atherosclerosis. Curr Drug Targets. 812, 1239-1248 (2007).
  5. Bonanno, E., Mauriello, A., Partenzi, A., Anemona, L., Spagnoli, L. G. Flow cytometry analysis of atherosclerotic plaque cells from human carotids: a validation study. Cytometry. 39, 158-165 (2000).
  6. Liu-Wu, Y., Svenningsson, A., Stemme, S., Holm, J., Wiklund, O. Identification and analysis of macrophage-derived foam cells from human atherosclerotic lesions by using a “mock” FL3 channel in flow cytometry. Cytometry. 29, 155-164 (1997).
  7. Galkina, E., Kadl, A., Sanders, J., Varughese, D., Sarembock, I. J., Ley, K. Lymphocyte recruitment into the aortic wall before and during development of atherosclerosis is partially L-selectin dependent. J Exp Med. 203, 1273-1282 (2006).
  8. Tung, J. W., Parks, D. R., Moore, W. A., Herzenberg, L. A., Herzenberg, L. A. New approaches to fluorescence compensation and visualization of FACS data. Clin Immunol. 110, 277-283 (2004).
  9. Smith, E., Prasad, K. M., Butcher, M. Blockade of interleukin-17A results in reduced atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice. Circulation. 121, 1746-1755 (2010).
  10. Eid, R. E., Rao, D. A., Zhou, J. Interleukin-17 and interferon-gamma are produced concomitantly by human coronary artery-infiltrating T cells and act synergistically on vascular smooth muscle cells. Circulation. 119, 1424-1432 (2009).

Play Video

Cite This Article
Butcher, M. J., Herre, M., Ley, K., Galkina, E. Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas. J. Vis. Exp. (53), e2848, doi:10.3791/2848 (2011).

View Video