Изоляция Носовые Обонятельные стволовых клеток от грызунов и человека

1. Сборник обонятельной выстилки у крыс Начните с подготовки трех 35 мм чашки Петри, заполненные DMEM / HAM F12 культуральной среде в чистом капот культуры. Любой способ эвтаназии должен быть заранее утверждены животных учреждение по уходу и использованию комитет и осуществляется квалифицированным персоналом. После крыса вошла глубокого наркоза натрия фенобарбитала или других инъекционных форм анестезии, такие как кетамин / ксилазина, обезглавить и снимите кожу. Ингалянтами анестетиков следует избегать. Адекватность анестезии будет оцениваться носок щепотку до обезглавливания. Снимите нижнюю челюсть с ножницами и с помощью костные кусачки, устраняют мимические мышцы с обеих сторон. Начиная с задней резцы, удалить с костные кусачки кости покрытие носовой полости, одна сторона за один раз. Обонятельных раковин появиться как оранжевый / коричневый органов, расположенных в задней части носа. Деликатно отказаться от раковин с щипцами. Использование 26 иглы, изолировать обонятельной выстилки лежал на перегородки резки ткани по трем направлениям: дуги перпендикулярно пластине, пластинка решетчатой ​​и потолок полости носа. Сбор биопсии с обеих сторон и передача их в DMEM / HAM F12 заполненные чашке Петри. Эта процедура не должна занять больше времени, чем на 10 минут от начала эвтаназии. Теперь, для того, чтобы удалить слизь, передача биопсии два раза в среднесрочной заполнены чашках Петри. 2. Сборник обонятельной выстилки у людей Эта процедура должна осуществляться нос уха и горла (ЛОР) Хирург, в соответствии с соответствующим местным этическим комитетом (ы), и каждый амбулаторно должны подписать форму информированного согласия. Использование 0 ° или 30 ° жесткий эндоскоп (4 мм), проверьте оба носовые полости и оценить предполагаемые наличие полипов или любого воспалительного поражения. Выберите лучший полости носа, с учетом отклонения перегородки. Использование хлопка аппликатор, нанесите местной анестезии, такие как лидокаин с адреналином, в течение 10 минут. С throughcut решетчатой ​​щипцами, собираем два квадратных миллиметра биопсия либо в корне медиальной средней раковины или на перегородку в дорзомедиальном области. Обонятельные биопсия затем передаются, используя стерильную иглу, в стерильный 2 мл трубки, заполненной 1 мл DMEM / HAM F12. Совет трубки вверх дном, чтобы убедиться, что биопсия погружается в культуральной среде. Вставьте трубку в рефрижераторный контейнер и транспортируют его к научно-исследовательской лаборатории. На данном этапе, биопсия может быть использован как таковой для сравнительных молекулярных исследований сосредоточено на конкретных заболеваниях головного мозга или обработанные для получения стволовых клеток. 3. Выделение стволовых клеток обонятельного от человека и крысы слизистой оболочки Вымойте биопсии в DMEM / HAM F12. Инкубируйте биопсии в чашке Петри заливается 1 мл dispase II решение (2,4 МЕ / мл), в течение 1 часа при температуре 37 ° C. Далее, при вскрытии микроскоп с перевернутой дифрагированного света, обонятельным эпителием удаляется из основных собственная пластинка использованием микро-шпателем. Обонятельный эпителий тоньше и выглядит полупрозрачным на черном фоне по сравнению с собственной пластинки которого разделяются оранжевый / коричневый. За белым фоном, эпителий выглядит серым и собственной пластинки, коричневый. Как только очищенную, передача собственной пластинки в чашке Петри заполнены DMEM / HAM F12. Если ткань от грызунов, а затем вырезать собственную пластинку на мелкие кусочки с двумя иглами 25 калибра. Затем перенесите штук 15 мл трубки, заполненной 1 мл коллагеназы IA. В трубке, с помощью стерильной пипетки пластиковые, диссоциируют ткани. Затем, инкубировать трубку в течение 10 минут при температуре 37 ° C. Для прекращения диссоциации, мягко рок трубки и добавить 9 мл Ca-Mg свободными и без PBS и центрифуга со скоростью 200 г в течение 5 минут. Ресуспендируют осадок клеток в DMEM / HAM F12 питательной среде с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, антибиотики и пластину на пластиковой посуды культуры. Теперь, если ткани человека, то ломтик собственную пластинку в 3 до 4 штук с мощностью от 200 до 500 мкм. Вставьте каждой полосы в свои 2 см блюдо культуры диаметра и покрывают стерильной ткани с 1,3 см в диаметре скользит стеклянной крышкой. Затем добавьте 500 мкл культуральной среды (DMEM / HAM F12 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и антибиотиков) для каждой культуры блюдо. Для любого типа ткани, обновить культуральной среды каждые 2 до 3 дней. Через пять-семь дней после того, стволовые клетки начинают вторгаться культуры блюдо и через две недели они должны быть вырожденным. Когда слияния будет достигнут, прохождения и передачи клеткам культуры колб. 4. Формирование сферы и нейронов Differentiation обонятельного стволовых клеток Для создания сфер стволовых клеток, инкубировать колбы в течение двух часов при температуре 37 ° C с поли-L-лизин. (ТЕКСТ: 5 г/см2). Пластина клеток при плотности 16000 клеток на квадратный сантиметр в обработанной колб. Каждые два дня, кормить клеток с 0,2 мл на квадратный сантиметр дополнена средой (DMEM / HAM F12 дополнить инсулин, трансферрин, селен (ITS-X, 1%), ЭФР (50 нг / мл) и FGF2 (50 нг / мл)). От двух до пяти дней, собрать плавающие сферы клеток и либо повторно пластины или отделить их перед прививкой на животных моделях клеточной терапии. Чтобы дифференцировать обонятельных стволовых клеток в нейрон-подобные клетки, культивировать их в течение 21 дней в Neurobasal среде, содержащей B-27, пенициллин, стрептомицин, глутамина и глутамата. Затем сделайте среда меняется каждые 3 дня. Нейрон-подобные клетки должны появиться через две-три недели. 5. Представитель Результаты: Носовые человека эксплантов-перерастает стволовые клетки (рис. 2А) делятся быстро и слияния может быть достигнута в течение одной-двух недель. Одной из ключевых особенностей stemness, нестин выражения, была оценена (рис. 2В). При росте на поли-L-лизин с бессывороточной культуральной среде дополнен ЭФР (50 нг / мл) и FGF2 (50 нг / мл), обонятельные стволовые клетки приводят к сфере (рис. 2С). При выращивании в сыворотке крови, содержащей культуральной среде вновь покрытием сферы порождают GFAP-клеток, экспрессирующих (~ 50%), тубулина-клеток, экспрессирующих (~ 10-15%) и O4-клеток, экспрессирующих (~ 2-5%) 9 (рис. 2D-F). Тем не менее, судьба сфере клеток, полученных могут быть изменены. Например, при выращивании в Neurobasal культуральной среде дополнен B27 и глутамата, большую часть носовых обонятельных стволовых клеток в нейроподобных клеток, экспрессирующих β-III тубулина (рис. 2G) и MAP2 (рисунок 2H). Рисунок 1. Общая схема эксперимента. Обонятельные биопсии слизистой оболочки вырезали из крысы или человека носовой полости. Эксплантов можно использовать как таковой для сравнительных молекулярных исследований в целях выявления биомаркеров в заболеваний головного мозга. Для выделения обонятельных стволовых клеток, взаимодействие между собственная пластинка и нервно-эпителия нарушается с dispase II фермент, и после 45 минут, эпителий удаляется с микро-шпателем. Грызунов стволовые клетки обонятельной далее выбран диссоциирующего собственную пластинку с коллагеназы IA. Для человеческой ткани, кусочков обонятельной собственная пластинка культивируют под стекло покровное, пока перерастает стволовые клетки проникают в целом хорошо. После распространения, с использованием подходящей культуральной среде, обонятельные стволовые клетки могут генерировать сфер или дифференцируются в нейрон-подобных клеток. Обонятельные стволовые клетки могут быть использованы для я) ремонт заболеваний мозга или травм или II) идентифицировать молекулярные маркеры заболеваний центральной нервной системы. Иллюстрации сделаны с помощью искусства Servier Medical. Рисунок 2. Культуры и дифференциации носового обоняния человека стволовые клетки. Человека стволовые клетки, растущие из собственной пластинки эксплантов () делятся быстро, при культивировании в сыворотке содержащей среде. Стволовые клетки экспрессируют маркер stemness нестин (B). При посеве на поли-L-лизин покрытием пластика и культивируется в бессывороточной культуральной среде дополнен ЭФР и FGF2, обонятельных стволовых клеток генерировать сфер (С). Сфера клеток, полученных, при посеве в сыворотке содержащих культуральной среде, приводит к GFAP-клеток, экспрессирующих (~ 50%), тубулина-клеток, экспрессирующих (~ 10-15%) и O4-клеток, экспрессирующих (~ 2-5%) 9 (DF). При выращивании в Neurobasal культуральной среде дополнен B27 и глутамата, они дифференцируются в нейроподобных клеток, экспрессирующих β-III тубулина (G) и MAP2 (H).