설치류 또는 인간의 네이절 강한 줄기 세포를 분리

1. 쥐에 강한 점막 수집 깨끗한 문화 모자 DMEM / 햄 F12 배지로 가득 세 35mm 페트리 요리를 준비하여 시작합니다. 안락사의 방법은 기관의 동물 관리 및 사용위원회의 사전 승인 및 자격을 갖춘 직원에 의해 수행되어야합니다. 쥐의 이러한 마취제 / xylazine으로 마취의 나트륨 pentobarbital 또는 기타 주사용 형태와 깊은 마취를 입력한 후, 참살하고 피부를 제거합니다. 흡입 anesthetics은 피해야한다. 마취의 타당성이 잘린하기 전에 발끝 핀치에 의해 평가됩니다. 가위로 아래턱을 제거하고 rongeur의 도움으로, 양쪽에있는 얼굴 근육을 제거합니다. incisors의 뒷면에서 시작 rongeur 비강, 한 번에 하나의 측면을 덮고있는 뼈 제거합니다. 오렌지 / 브라운 기관은 코 뒤쪽에 위치한으로 후각 turbinates가 보이기 시작하다. 정교한 포셉로 turbinates 폐기하십시오. 수직 판, 소공 질의 판과 비강의 천장의 아크 : 26 게이지 바늘을 사용하여 세 줄을 따라 조직을 절단하여 심장에 누워 후각 점막을 분리. 양쪽에 biopsies를 수집하고 DMEM / 햄 F12 – 가득한 페트리 접시에서 그들을 전송합니다. 이 절차는 발병 안락사에서 10 분 이상 안 걸릴 것입니다. 자, 가래를 제거하기 위해, 중간 가득한 배양 접시에 biopsies 두 번 전송합니다. 2. 인간의 강한 점막 수집 이 절차는 해당 지역 윤리위원회 (S)에 따라, 귀 코 스로트 (ENT) 외과 의사에 의해 실시되어야하고, 모든 외래는 정보 동의서에 서명해야합니다. 0 ° 또는 30 ° 단단한 내시경 (4mm 직경)를 사용, 코와 충치를 모두 검사하고 폴립이나 염증성 병변의 putative 존재를 평가. 계정에 심장의 편차를 복용, 최고의 비강을 선택합니다. 면화 작은 주걱을 사용하여 10 분, 에피네프린과 같은 lidocaine과 같은 국소 마취제를 적용할 수 있습니다. throughcut 사골 집게와 가운데 turbinate의 중간 부분의 루트 또는 dorsomedial 지역에서 심장에 중 두 평방 밀리미터 생검를 수집합니다. 후각 생검은 다음 DMEM / 햄 F12 1 ML 가득 살균이 ML 관에, 멸균 바늘을 사용하여 전송됩니다. 생검이 문화 매체에 잠겨 있는지 확인하기 위해 거꾸로 튜브를 팁. 냉장 컨테이너에 튜브를 삽입하고 연구실에 수송. 이 단계에서는 생검은 특정 뇌 질환에 초점을 맞춘 또는 줄기 세포 생성에 대한 처리 비교 분자 연구 글 사용할 수 있습니다. 3. 인간과 쥐 점막에서 강한 줄기 세포의 분리 DMEM / 햄 F12에 biopsies 씻으십시오. 37 1 시간, dispase II 솔루션 (2.4 IU / ML) 1 ML 가득한 페트리 접시에 biopsies을 품어 ° C. 다음 diffracted 거꾸로 조명과 해부 현미경, 후각 상피는 마이크로 주걱을 사용하여 기본 라미나의 propria에서 제거됩니다. 후각 상피는 스트 라이프입니다 라미나의 propria에 비해 얇은이며 검은 배경 위에 반투명 보이는 주황색 / 갈색. 흰색 배경에 걸쳐 상피는 회색과 라미나의 propria, 갈색 보인다. 일단 정화, DMEM / 햄 F12 가득한 페트리 접시에 얇은 판의 propria를 전송할 수 있습니다. 조직은 설치류에서있다면,이 25 게이지 바늘로 작은 조각으로 라미나의 propria 잘라. 그런 다음, collagenase IA 1 ML 가득 15 ML 튜브에 조각을 전송합니다. 튜브에서 멸균 플라스틱 피펫을 사용하여 조직을 떼어 놓다. 그렇다면, 37에서 10 분 동안 튜브를 품어 ° C. 분리를 종료하려면, 부드럽게 튜브를 바위와 구 CA – 무료 MG – 무료 PBS의 ML과 5 분 200g에 원심 분리기를 추가합니다. 플라스틱 문화 요리 10 % 태아 송아지 혈청, 항생제 및 플레이트와 함께 보충 DMEM / 햄 F12 배지에서 세포 펠렛을 Resuspend. 이제 조직 인간있다면, 그때 200-500 μm의 이르는 두께 3-4 조각으로 라미나의 propria를 슬라이스. 자체 2cm 직경 문화 요리에 각 스트립을 삽입하고 무균 1.3 cm 직경의 유리 커버 풀렸는데로 조직을 커버. 그런 다음, 각 문화 요리에 배지 500 μl (DMEM / 햄 F12 10% 소태아 혈청과 항생제로 보충)을 추가합니다. 어느 조직 유형에 대한 모든 2-3일 문화 매체를 갱신. 5 ~ 7 일 후에, 줄기 세포는 문화 접시를 침공하기 시작하고 2 주 후에 그들이 합류한다. , 통로에 도달하고 문화 flasks에 전지를 전송할 때 confluency. 4. 영역의 형성과의 연결 Differe강한 줄기 세포의 ntiation 줄기 세포 분야를 생성하려면, 37 두 시간 동안 flasks을 품어 ° 폴리 – L – 라이신과 C. (텍스트 : 5 g/cm2). 취급 flasks에 cm2 당 16,000 세포의 밀도에 플레이트는 세포. 이틀, 보충 매체 cm2 당 0.2ml (DMEM / 햄 F12 인슐린, 트랜스페린, 셀레늄 (ITS – X, 1 %), EGF (50 NG / ML)과 FGF2 (와 보충으로 세포를 공급 50 NG / ML)). 2 ~ 5 일 후, 부유 세포 분야 및 중 다시 플레이트를 수집하거나, 세포 치료의 동물 모델에 이식하기 전에 그들을 떼어 놓다. 신경 세포와 같은 세포에 후각 줄기 세포를 차별화하는 데, B – 27, 페니실린, 스트렙토 마이신, 글루타민 및 글루 탐 산염을 포함 Neurobasal 매체를 21 일 동안 그들을 육성. 그렇다면 매 3 일마다 중간 변경합니다. 신경 세포와 같은 세포 두 시간 3 주 후에 나타납니다. 5. 대표 결과 : 비강 인간 explant – 뚫고 나올 때까 줄기 세포 것은 (그림 2A) 급속도로 나누어하고 confluency가 1-2주 이내에 도달할 수 있습니다. stemness 중 하나는 주요 기능 nestin 발현은 (그림 2B) 평가했습니다. EGF (50 NG / ML)과 FGF2 (50 NG / ML)로 보충 혈청이없는 배지와 폴리 – L – 라이신에 성장하면 후각 줄기 세포 분야 (그림 2C)을 일으키다. 혈청 함유 배지에서 재배하면 새로 도금 분야는 GFAP – 표현 세포 (~ 50 %), tubulin – 표현 전지 (~ 10-15%)과 O4 – 표현 세포 (~ 2~5%) 9 (그림을 일으키다 2D – F). 그러나, 구체 파생 세포의 운명을 수정할 수 있습니다. 예를 들어, B27 및 글루 탐 산염, β – III의 tubulin (그림 2G)와 MAP2 (그림 2 시간)를 표현하는 신경 세포와 같은 세포로 비강 후각 줄기 세포의 대부분과 함께 보충 Neurobasal 배지 재배시. 그림 1. 실험의 전체 계획. 후각 점막의 biopsies는 쥐 또는 인간의 비강에서 excised 수 있습니다. Explants는 뇌 질환의 생체를 식별하는 목표 비교 분자 연구 글 사용할 수 있습니다. 후각 줄기 세포를 분리 들어, 라미나의 propria 및 신경 상피 사이의 상호 작용 45 분 후에 상피가 마이크로 주걱과 제거, dispase II 효소를 방해하고 있습니다. 쥐 후각 줄기 세포는 더욱 collagenase 아이오와 라미나의 propria를 dissociating으로 선택됩니다. 뚫고 나올 때까 줄기 세포가 아니라 전체를 침략하기 전까지 인간의 조직을 위해, 후각 라미나의 propria 조각은 유리 coverslip 아래 양식입니다. 증식 후, 적절한 배지를 사용하여 후각 줄기 세포 분야를 생성할 수 있습니다 또는 신경 세포와 같은 세포로 구분. 후각 줄기 세포는 내가하는 데 사용할 수있는) 수리 뇌 질환이나 외상 또는 II)는 중추 신경계 질환의 분자 마커를 식별합니다. 삽화는 Servier 의료 예술의 도움으로 만들어집니다. 그림 2. 문화와 비강 인간의 후각 줄기 세포의 분화. 혈청 함유 배지 재배시 라미나 propria explant (A) 밖으로 성장하는 인간의 줄기 세포가 빠른 속도로 나누어 있습니다. 줄기 세포는 stemness 마커 nestin (B)를 표현한다. 폴리 – L – 라이신 – 코팅 플라스틱에 도금 및 EGF와 FGF2와 보충 혈청이없는 배지에서 재배 때, 후각 줄기 세포 분야 (C)를 생성합니다. 영역 – 파생 세포, 혈청 함유 배지에서 도금 때 상승을주고 GFAP – 표현 세포 (~ 50 %), tubulin – 표현 전지 (~ 10~15%)과 O4 – 표현 세포 (~ 2~5%) 9 (DF). B27 및 글루 탐 산염과 보충 Neurobasal 문화 매체 재배 때, 그들은 β – III의 tubulin (G)와 MAP2 (H)를 표현하는 신경 세포와 같은 세포로 구분.