隔离啮齿类动物或人类的鼻嗅干细胞

1。收集大鼠嗅黏膜首先，准备3张35毫米的Petri菜与F12在一个干净的文化引擎盖DMEM /火腿培养基充满。 任何“安乐死”的方法，必须由该机构的动物护理和使用委员会的事先批准，由合格的专业人员进行的。大鼠戊巴比妥钠或其他如氯胺酮/甲苯​​噻嗪注射麻醉形式进入深麻醉后，斩首和消除皮肤。应避免吸入麻醉药。麻醉充足，将评估前脚趾捏斩首。取出，用剪刀下颚和咬骨钳的帮助下，消除双方的面部肌肉。 从门牙的背面，用咬骨钳的鼻腔，一次一侧的骨覆盖删除。嗅觉鼻甲进入人们的视线，橙色/棕色机关在位于鼻子后面。 娇柔与镊子丢弃的鼻甲。使用26号针头，隔离嗅粘膜，隔躺在沿着三条线切割组织：弧的垂直板，筛板和鼻腔上限。 对双方收集的活组织切片检查和转让他们在DMEM /火腿F12 -填充培养皿。这个过程不应该需要更长的时间超过10分钟从一开始安乐死。 现在，以去除黏液，转移中充满培养皿两次活组织切片检查。 2。在人类嗅黏膜收集此过程应进行一个耳鼻喉科（ENT）操刀，根据与当地有关的伦理委员会（S），每门诊应签署知情同意书。 使用0 °或30 °刚性内窥镜（直径4 mm），两个鼻腔检查和评估假定存在的息肉或炎性病变。选择最佳的鼻腔，考虑到隔的偏差。 使用棉花撒施，申请与肾上腺素，如利多卡因局部麻醉，10分钟。 随着throughcut筛窦钳，收集了两个平方毫米活检在根中鼻甲内侧面或隔背内侧区。 然后转移的嗅觉活检，是使用消毒针头，进入无菌2毫升1毫升的DMEM / HAM F12满管。提示管倒挂，以确保活检是在培养液中浸泡。 插入管和一个冷藏集装箱运输研究实验室。在这个阶段，可用于活检本身比较分子的研究集中在特定的大脑疾病或产生干细胞的处理。 3。从人类和大鼠胃黏膜嗅觉干细胞的分离 F12的DMEM /火腿洗净的活组织切片检查。在充满1毫升dispase II解决方案（2.4 IU / ml）的一个培养皿培养活检1小时，在37 ° C。 接下来，解剖显微镜下的衍射倒光，嗅觉上皮被删除从基础层，用微型抹刀固有。 嗅上皮更薄，看起来比黑色的背景相比，固有层，这是条纹的半透明橙/棕。上皮细胞在一个白色背景，看起来灰色和固有层，褐色。 纯化后，转移到培养皿用DMEM / HAM F12填补了固有层。 如果从啮齿类动物的组织，然后切成小块，与两个25表针固有层。然后，充满了1毫升胶原酶IA 15毫升管件。 在管内，用无菌塑料吸管，游离于组织。然后，管孵育10分钟，37 ° C。 要终止的解离，轻轻摇动试管，加9毫升的无钙和镁无PBS离心5分钟，在200克。 DMEM /火腿F12文化与10％小牛血清，抗生素和塑料培养皿板培养基重悬细胞沉淀。 现在，如果该组织是人类，然后片成3至4件厚度从200至500微米不等的固有层。 插入到它自己的直径2厘米的培养皿每个地带，并覆盖无菌直径1.3厘米的玻璃盖玻片的组织。 然后，每个培养皿中添加500μL培养基（DMEM /火腿F12与10％小牛血清和抗生素的补充）。 对于任何一个组织的类型，更新培养液中，每2至3天。 五到七天后，干细胞就开始侵入了培养皿中，两个星期后，他们应融合。当汇合，通过转移的细胞培养瓶中。 4。圈的形成和神经Differentiation的嗅觉干细胞要生成干细胞球，两个小时的烧瓶在37 °彗星与聚- L -赖氨酸。 （文：5 g/cm2）。 板的细胞密度在每平方厘米1.6万细胞在治疗烧瓶。 每隔两天，饲料0.2毫升每平方厘米的培养基（DMEM培养液/火腿F12补充胰岛素，转铁蛋白，硒（ITS – X，​​1％），表皮生长因子（50毫微克/毫升）和FGF2（细胞50毫微克/毫升））。 2到5天之后，收集漂浮的细胞球，要么重制版或游离移植细胞治疗的动物模型前。 嗅觉干细胞分化成神经元样细胞，培养21天Neurobasal培养基中含有的B – 27，青霉素，链霉素，谷氨酰胺和谷氨酸。 然后进行中的变化，每3天。神经元样细胞后，应该会出现两至三个星期。 5。代表性的成果： 鼻人类植体outgrowing干细胞（图2A）除以迅速汇合，可一到两周内达成。一个关键的功能，干性，nestin表达，是评估（图2B）。聚- L -赖氨酸时用无血清培养与表皮生长因子（50毫微克/毫升）和FGF2（50毫微克/毫升）的培养基中生长，嗅觉干细胞引起的领域（图2c）。在含血清培养基中生长时，新镀领域引起GFAP的表达（〜50％），微管蛋白表达的细胞（约10-15％）和O4的表达细胞（约2-5％） 9（图2D – F）的。然而，球体源性细胞的命运可以被修改。例如，当一个Neurobasal文化与B27与谷氨酸，最鼻腔嗅觉干细胞向神经元样细胞表达的β- III微管蛋白（图2G）和微管相关蛋白2（图2H）培养基中生长。 图1实验的总体方案。切除大鼠或人体鼻腔嗅粘膜活检。外植体本身可用于比较，目的是查明在脑部疾病的生物标志物的分子生物学研究。隔离嗅觉干细胞，固有层和神经上皮细胞之间的相互作用与dispase二酶被破坏，45分钟后，上皮细胞是用微锅铲删除。啮齿动物的嗅觉干细胞进一步游离胶原酶IA固有层选择。对人体组织，件嗅觉固有层玻璃盖玻片培养干细胞的侵入，直到outgrowing以及整个。扩散后，用适当的培养基，嗅觉干细胞可以生成领域，或分化成神经元样细胞。嗅觉干细胞可用于I）修复脑部疾病或外伤或ii）确定中枢神经系统疾病的分子标记。插图与施维雅医药艺术的帮助。 图2，文化和人类鼻嗅干细胞的分化。越来越多的固有层植（一）人类干细胞迅速分裂，在含血清培养基培养。干细胞表达的干性标记巢（二）。当镀上聚- L -赖氨酸涂层的塑料，在无血清培养与EGF和FGF2培养基栽培，嗅觉干细胞生成领域（三）。球衍生的细胞，在含血清培养基镀时，会引起GFAP的表达细胞（〜50％），微管蛋白表达细胞（10-15％）和O4的表达细胞（约2-5％） 9（DF）的。在Neurobasal文化与B27与谷氨酸培养基生长时，它们分化成神经元样细胞表达的β- III微管蛋白（G）和微管相关蛋白2（H）。