محاذاة الألياف electrospun مباشر على نمو الخلايا العصبية في المختبر ، وتشكل عنصرا إمكانات التجدد السقالات العصبية. وصفنا إجراء لإعداد ركائز الألياف electrospun وثقافة خالية من المصل الأولية الحسية E15 الفئران (DRG) والخلايا العصبية الحركية. كما يتم تضمين التصور من الخلايا العصبية التي كيمياء سيتولوجية مناعية.
Electrospinning هو أسلوب لإنتاج نانو في الدقيقة النطاق الألياف. يمكن electrospun الألياف مع درجات متفاوتة من المواءمة ، من الانحياز إلى حد كبير عشوائية تماما. بالإضافة ، يمكن نسج الألياف من مجموعة متنوعة من المواد ، بما في ذلك البوليمرات القابلة للتحلل مثل بولي – L – حامض اللبنيك (PLLA). هذه الخصائص تجعل الألياف electrospun مناسبة لمجموعة متنوعة من التطبيقات السقالات في هندسة الأنسجة. تركيزنا هو على استخدام الألياف electrospun الانحياز لتجديد العصبية. لقد أظهرنا سابقا أن محاذاة الألياف electrospun PLLA ثمرة مباشرة من كل من الخلايا العصبية الحسية والحركية الأساسية في المختبر. ونحن نرى أن استخدام نظام الخلية الأولية الثقافة أمر أساسي عند تقييم المواد الحيوية إلى الخلايا العصبية الموجودة في النموذج الحقيقي فيفو بقدر الإمكان. هنا ، نحن تصف التقنيات المستخدمة في المختبر لدينا electrospin السقالات ليفية والثقافة العقد الجذرية الظهرية explants ، فضلا عن فصل الخلايا العصبية الحسية والحركية ، على السقالات electrospun. ومع ذلك ، يتم تكييفها بسهولة وelectrospinning / أو تقنيات الثقافة المعروضة هنا للاستخدام في التطبيقات الأخرى.
هذا البروتوكول وخطوات حاسمة عدة. الأول ينطوي على الإنتاج السليم للركائز electrospun الألياف. السائل في وسائل الإعلام ، فإن الألياف PLLA ، فيلم PLGA وخندق PLGA منفصلة عن الزجاج زلة تغطية كوحدة واحدة. إذا تم حذف PLGA ، فإن الألياف PLLA لا تبقى ورقة مسطحة — أنها سوف عقص الى تشابك غير صالحة للاستعمال. وبالتالي ، يتم تضمين الفيلم باعتباره الركيزة PLGA مناسبة للحفاظ على محاذاة الألياف خلال الثقافة. إضافة الخندق بعد الغزل على حد سواء لضمان أن يتم إصلاح آمن الألياف للفيلم PLGA وإضافة التصلب الهيكلي للفيلم. الخندق أيضا بمثابة مؤشر مفيد عندما يتم معالجته خلال تثبيت ركائز ، وتلطيخ والتركيب. سحن هو الخطوة الثانية الحاسمة. وينبغي بذل كل جهد ممكن لتجنب تكون فقاعات. بالإضافة إلى ذلك ، لقد حصلنا على عوائد أعلى من ذلك بكثير عند استخدام ماصة النار مصقول لهذه الخطوة. إطلاق البولندية ، وعلى ضوء ناسخ بنسن وإرفاق لمبة للماصة. تمرير غيض من ماصة بسرعة من خلال الشعلة 2-3 مرات في حين الضغط باستمرار والافراج عن لمبة — تدفق الهواء من خلال ماصة سوف تساعد على منع غيض من إغلاق تماما. دراسة غيض من ماصة لضمان ثقب لا يزال مفتوحا وأن تظهر حواف مدورة قليلا قبل الاستخدام.
Electrospinning هو عملية متعددة جدا ، ويمكن تعديل المعلمات electrospinning لإنتاج الألياف مع مجموعة متنوعة من morphologies. تان وآخرون (2005) تفاصيل دراسة منهجية للمعلمات التي تؤثر في القطر من ألياف electrospun PLLA. وانغ وآخرون (2009) يقدم دراسة مفصلة من المعلمات التي تؤثر في محاذاة الألياف PLLA electrospun.
The authors have nothing to disclose.
NIH K08 EB003996
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
PLLA | Boehringer Ingelheim | Resomer L210 | ||
PLGA 85:15 | Sigma | 43471 | ||
L15 | Gibco | 11415 | ||
Albumin | Sigma | A2289 | ||
Apo-transferrin | Akron | AK8227 | ||
Biotin | Fisher | AC 23009-0010 | ||
Galactose | Sigma | G0625 | ||
Progesterone | Sigma | P7556 | ||
Putrescine | Sigma | P5780 | ||
Selenium | Sigma | S9133 | ||
β-estradiol | Sigma | E 1132 | ||
Hydrocortisone | Sigma | H0396 | ||
Catalase | Sigma | C40 | ||
Superoxide dismutase | Sigma | S4636 | ||
Neurobasal | Gibco | 21103-049 | ||
PSN | Gibco | 15640 | ||
L-glutamine | Nalgene | 1680149 | ||
Trypsin | Nalgene | 1689149 | ||
Fetal bovine serum | Gibco | 26140 | ||
Optiprep | Accurate | 2011 | ||
PLL | Sigma | P4832 | ||
Fibronectin | Sigma | F 4759 | ||
Laminin | Invitrogen | 23017-015 | ||
B27 | Gibco | 17504-044 | ||
BSA | Sigma | A7906 | ||
Anti-TuJ1 | BD Biosciences | 556321 | ||
Anti-neurofilament | Millipore | AB1987 | ||
Anti-S100 | Sigma | S2532 | ||
Anti-NGFR p75 | Sigma | N3908 | ||
Normal goat serum | Sigma | G6767 | ||
Triton X-100 | Sigma | T9284 | ||
Sodium azide | Sigma | S8032 | ||
Carbon tape | Ted Pella | 13073-1 | ||
Prolong Gold +DAPI | Invitrogen | P36931 |