La cultura de la motora primaria y las neuronas sensoriales en los medios de comunicación definidas en Electrospun poli-L-láctico andamios nanofibras

1. Poli-L-láctico (PLLA) Spinning Solución Disolver 0,4 g PLLA en 9 ml de cloroformo, agitando a fuego lento. Añadir 1 ml de dimetilformamida a la solución, con lo que la concentración final de la solución al 4% PLLA (w / v) en cloroformo: DMF 9:1 (v / v). Ponga la solución en una jeringa de vidrio o polipropileno, con una punta de metal 23ga contundente. 2. Spinning Preparación del substrato 1 Hacer una solución al 8% (w / v) de 85:15 PLGA (poli-láctico-co-glicólico) en cloroformo, agitando a fuego lento. Capa limpia cubierta de vidrio se desliza en PLGA cubriendo la superficie de cada hoja de la cubierta con la solución de PLGA. Deje que el PLGA para secar a una capa delgada (aprox. 30 min). 3. Electrospinning 2 Asegure la cubierta de vidrio recubierta PLGA se desliza al colector con una cinta de carbón conductor. Para las fibras alineadas, el colector es una rueda con motor. Para las fibras de azar, el colector es una placa estacionaria. Coloque la jeringa en la bomba con la punta de 20 cm de la rueda del colector. Conjunto de la bomba de aproximadamente 2 ml / hora y si se utiliza una rueda, ajustar el motor a 300-400 RPM. Si es posible, aplicar un sesgo -2 kV DC para el colector y 15 kV hasta la punta de metal. Ante la falta de acceso a una fuente de alimentación bipolar, baja del colector. Las fibras se chorro de la punta de la jeringa y se acumulan en la rueda giratoria. Continúe girando hasta que la densidad deseada de las fibras se obtiene. Pase la punta de metal con una toalla de papel colocada en una barra no conductora periódicamente para evitar la obstrucción en la punta. 4. Moating 1 Girar a continuación, 'foso' las muestras electrospun pipeteando una línea de PLGA en todo el perímetro de la hoja de la cubierta. Deje que el PLGA que se seque. Esto mantendrá la alineación de las fibras durante el cultivo. 5. Proteína de revestimiento Electrospun fibras y los controles de vidrio debe ser recubierto en proteínas antes de cultivo celular. Cubrir los sustratos en una solución de proteínas, por lo menos una hora y luego aspirar el exceso de solución y seguir aspirando hasta que los sustratos están secos. Posibles soluciones de proteínas son: PLL (poli-L-lisina) (100 mg / mL), laminina (25 mg / ml) o la fibronectina (50 mg / mL). Si PLL se utiliza, los sustratos deben ser enjuagados con agua estéril y seca dos veces después de la capa inicial. 6. Obtener embriones de rata E15 3 * Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con la Guía del NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio aprobado por la Universidad de Michigan Comité de Uso y Cuidado de Animales. Preparación: Compruebe si el animal está embarazada. Descongele los 3 ml de tripsina, 3 ml de FBS y calentar un biberón de L15. Fuego pulir una pipeta Pasteur. Desinfectar todos los instrumentos quirúrgicos en el 70% de etanol durante 30 min. Preparar y calentar el medio de placas (ver Tabla 1). Eutanasia: Realizar una inyección IP de ketamina / xilazina. Espere 10-15 minutos y comprobar por falta de la córnea y el pedal de reflejos de retirada. Una vez que los reflejos están ausentes, realice una inyección de pentobarbital IC (FatalPlus). La tienda de la piel del abdomen. Corte a través de la piel y las capas musculares para exponer la cavidad abdominal. Localizar el útero y separarlo en el cuello del útero y los ovarios. La toma de embriones del útero con una tijera y colocarlos inmediatamente en caliente L15. (Todos los siguientes procedimientos se realizan bajo un microscopio de disección y los embriones y los cables de disección debe ser sumergido en agua tibia L15 en todo momento.) Decapitar a los embriones por el cierre de pinzas alrededor de la barbilla y debajo del hueso occipital del cráneo. 7. Disección de 3 Coloque el embrión de un lado. Proteger la médula espinal con un juego de pinzas, mientras que con el otro despojarnos de las extremidades y los órganos abdominales. A su vez el embrión y mantenerlo fijo con un juego de pinzas. Recorte a lo largo del embrión, desde el cuello hasta la cola, hasta que toda la médula está expuesto. Sujete el extremo del cable con cuidado y tire de ella sobre sí misma hacia la cola para retirar. El cable se tire libre con membrana y ganglios de la raíz dorsal (GRD) adjunto. Si DRG explante o cultura disociada neurona sensorial se va a realizar, cortar la DRG de la médula y la transferencia a un plato fresco de tibia L15. Por DRG explante cultura, con el paso 10.2 Para el cultivo disociado de neuronas sensoriales, vaya al paso 9 Para el motor cultura neurona, el DRG se eliminará con la membrana en el paso 7.5 Quitar la membrana de la médula espinal, sujetándola en el extremo superior de la médula y el pelado hacia abajo, similar a la eliminación de una media de largo. Repita este procedimiento para todos los embriones y luego cortar los cables en pequeños (2-3 mm) piezas. <pclass = "jove_title"> 8. De las neuronas motoras (MN) Procesamiento de 5,6,7 Vierta los cables cortados y L15 en una forma cónica y giran a 1000 rpm durante 2-3 minutos para que sedimenten las piezas. Retirar el sobrenadante y agregar 3 ml de tripsina a los cables de pellets. Incubar en un baño de agua a 37 ° C durante 20 min. Añadir 3 ml de FBS cónica y giran a 1000 rpm durante 2-3 min para volver a pellet. Retirar el sobrenadante y la capa de un incendio pulido pipeta Pasteur con FBS. Añadir una pipeta Pasteur, lleno de L15 a la cónica y luego se tritura suavemente hasta que la solución es homogénea sin grumos visibles. Evitar las burbujas. Prepare una solución de 9% de Optiprep en L15. Preparar un tubo con 3 ml de la solución Optiprep por cada dos embriones (si hay un número impar de embriones, redondear). Caída de la solución homogeneizada en la solución Optiprep, dividiéndola en partes iguales entre todos los tubos. Girar los tubos a 2000 rpm durante 15 minutos. Recoger cuidadosamente los 2 ml de cada tubo y la piscina en un Erlenmeyer de 50 ml. Llene el cono con L15 y giran a 1000 rpm durante 5 minutos para enjuagar las células de Optiprep. Retirar el sobrenadante y resuspender las células en una pequeña cantidad de medios de chapado (250 a 500 l). Contar las células con azul de tripan exclusión para identificar las células vivas. Vaya al paso 10.1 9. Neurona sensorial (SN) de elaboración 7 Vierta el DRG eliminado de la médula espinal y L15 en un tubo cónico y giran a 1000 RPM durante 2-3 min para precipitar las piezas. Retirar el sobrenadante y agregar 3 ml de tripsina a la DRG granulado. Incubar en un baño de agua 37 ° C durante 10 min. Añadir 3 ml de FBS cónica y giran a 1000 rpm durante 2-3 min para volver a pellet. Retirar el sobrenadante y la capa de un incendio pulido pipeta Pasteur con FBS. Añadir una pipeta Pasteur, lleno de L15 a la cónica y luego se tritura suavemente hasta que la solución es homogénea sin grumos visibles. Evitar las burbujas. Girar el homogenado a 1000 rpm durante 5 min. Retirar el sobrenadante y resuspender las células en una pequeña cantidad de medios de comunicación placas SN (250-500 l). Contar las células con azul de tripan exclusión para identificar las células vivas. Continúe con el paso 10.1 10. Revestimiento y Cultura Para disociar SN o la cultura MN: Cubrir los sustratos con unas gotas de los medios de comunicación a continuación, agregar un volumen apropiado de la suspensión celular. Las células disociadas se sembraron a una densidad baja (25-50 células / mm 2). Permitir que las células se adhieran por lo menos una hora antes de la inundación de los pozos con los medios de comunicación. Por DRG explante cultura: Cubrir los sustratos con unas gotas de los medios de comunicación a continuación, añadir DRG a los medios de comunicación. Organizar los GRD para que se distribuyen uniformemente a través del substrato (aproximadamente 4 DRG caben en una hoja de 22×22 mm cubierta). Deje que el GRD que se adhieran durante al menos 4 horas antes de la inundación de los pozos con los medios de comunicación. Culturas se puede mantener durante un máximo de 4 días sin cambiar los medios de comunicación. Durante más tiempo las culturas, la mitad de los cambios medios de comunicación se debe hacer con los medios de alimentación. Alimentar a los medios de comunicación es la misma composición que los medios de comunicación placas menos la L-glutamina. 11. Inmunocitoquímica 1,5,8 La fijación de las células: los medios de comunicación Aspirar y reemplazar con agua tibia 4% PFA (paraformaldehído) durante 30 minutos. A continuación, realizar 3 veces 5 min lavados con PBS 1x. Bloqueo / permeabilización: Prepare bloque / perm solución (1,25% de suero albúmina bovina en PBS 1X, un 0,05% Triton X-100 y el 2,0% de suero normal de cabra). Aspirar PBS y aplicar bloque / permanente solución a las muestras durante 30 minutos. A continuación, realice 1X 5 min lavados con PBS 1x. Anticuerpo primario: Preparar la solución de anticuerpo primario de trabajo (10% de suero normal de cabra, un 1,25% de albúmina sérica bovina, el 0,1% de azida Na, 0,05% de Triton X-100 y 10 ml con 1x PBS). Añadir la cantidad apropiada de anticuerpo primario (ver Tabla 2). Línea de varios platos con parafilm. Coloque un cordón de 200μl de solución de anticuerpos primarios en la parafina para cada sustrato. Invertir los sustratos, flotando a la par de la celda hacia abajo en la solución de anticuerpo primario de trabajo durante la noche (si la habitación tiene aire acondicionado o en seco sobre todo, un pedazo de papel saturado de agua se pueden agregar a una esquina del plato para evitar la evaporación de la solución de trabajo) . Anticuerpo secundario: Retire los sustratos de la primaria (la solución de trabajo pueden ser recogidos, almacenados a 4 ° C y reutilizar) y llevar a cabo 2 veces 5 min lavados con PBS 1x. Aplicar 200 l de anticuerpos secundario diluido 1:200 en PBS (también se invierte en un plato forrado parafina) durante 4 horas. Eliminar de secundaria a continuación, realizar 2 veces 5 min lavados con PBS 1x. Soportes de montaje en láminas de oro con prolongar la DAPI u otro contador nuclear adecuada mancha. 12. Los resultados representativos: La morfología típica de alineado y El azarfibras ectrospun se muestra en la Figura 1. Por lo general obtener la pureza de la MN> 90% 7,8 neuronas con este protocolo y hemos mantenido DRG culturas durante todo el tiempo como una semana sin ningún tipo de crecimiento de fibroblastos significativo. La figura 2 muestra la apariencia típica de MN en fibras de vidrio y después de 24 horas de la cultura y la inmunotinción. DRG immunostained cultivadas durante tres días en fibras de vidrio y se muestra en la Figura 3. Figura 1. Alineación de la fibra es manipulado por la elección de los colectores. A.) Alineados fibras hiladas en un colector de rueda giratoria y B.) hilar fibras al azar en un colector de placa estacionaria. Las barras de escala = 20 micras. Figura 2. Representante neuronas motoras teñidas Tuj1 (verde) y DAPI (azul) después de 24 horas de la cultura en A. recubierto PLL) fibras y B) de cristal. Las barras de escala = 20 micras. Figura 3. Manchada Representante DRG para neurofilamentos (verde) después de 3 días de cultivo en el PLL recubiertas A.) de vidrio y B) las fibras. Las barras de escala = 200 micras. Solución de reserva: MN medios de comunicación: DRG / SN medios de comunicación: 10 mg mL -1 albúmina 12,5 l – 10 mg mL -1 apo-transferrina 50 l 40 ml 50 mg mL -1 β-estradiol 2,7 l 2,2 l 0,1 mg mL -1 biotina 50 l – 16 mg mL -1 catalasa L 8 – 15 mg mL -1 D-galactosa 50 l – 50 mg mL -1 de hidrocortisona 3,7 l 2,9 l 0,63 mg mL -1 de progesterona 0,5 l – 16 mg mL -1 putrescina 50 l – 50 mg mL -1 selenio 3,4 l 4,1 l 2,5 mg mL -1 superóxido dismutasa 50 l – * 500 ng ml -1 nervio del factor de crecimiento – 1 mL * 100X PSN 0,5 ml 0,5 ml * B27 1 mL 1 mL * 2 mM L-glutamina 35 l 35 l * Neurobasal a 50 ml a 50 ml Tabla 1. Añadir asterisco (*) los componentes de los medios de comunicación justo antes del uso. El resto de componentes se pueden preparar como una solución de reserva y se mantiene a -20 ° C hasta el momento de 6,7. Primaria (concentración) Las neuronas: Glia: Fibroblastos: anti-β-tubulina (Tuj1) (1:1000) ✓ X X anti-neurofilamentos (1:1000) ✓ X X anti-S-100 (1:250) X ✓ ✓ anti-p75 NGFR (1:500) ✓ ✓ X Tabla 2. La selección de anticuerpo primario depende de los objetivos del investigador. Los anteriores son varios anticuerpos y las concentraciones que se han utilizado con éxito en nuestro laboratorio. S-100 es especialmente útil para identificar las células de Schwann y / o detectar la contaminación fibroblastos, pero tenga en cuenta que se debe utilizar en combinación con NGFR p75 para distinguir entre células gliales y fibroblasts4. También hemos notado que NGFR p75 manchas neuritas muy ligeramente, mientras que neurofilamentos o Tuj1 son excelentes opciones si el objetivo es visualizar neuritas individual.