1. Поли-L-молочная кислота (PLLA) прядильного раствора Растворите 0,4 г PLLA в 9 мл хлороформа при перемешивании на медленном огне. Добавьте 1 мл диметилформамида к решению, в результате чего конечная концентрация раствора до 4% PLLA (м / о) в хлороформе: DMF 9:1 (объем / объем). Место решения в полипропиленовые или стеклянные шприцы с тупым кончиком 23ga металла. 2. Спиннинг Подготовка основания 1 Сделать 8% (вес / объем) раствор 85:15 PLGA (поли-молочной-со-гликолевой кислоты) в хлороформе при перемешивании на медленном огне. Пальто чистую стеклянную крышку сползает в PLGA, покрывая поверхность каждой покровным стеклом с решением PLGA. Разрешить PLGA сушить на тонкую пленку (около 30 мин). 3. Электропрядения 2 Безопасные PLGA мелованной обложкой стекла скользит к коллектору с проводящей ленты углерода. Для выровнены волокон, коллектор с приводом от двигателя колеса. Для случайных волокон, коллектора стационарных пластины. Место шприца в насос с наконечником 20 см от коллектора колеса. Установить насос около 2 мл / час, а при использовании колес, установить двигатель до 300-400 оборотов в минуту. Если это возможно, применять -2 кВ постоянного тока смещения на коллекторе и +15 кВ до металлическим наконечником. В отсутствие доступа к питания биполярного землю коллектора. Волокна будет струи из наконечника шприца и собирать на вращающемся колесе. Продолжить спиннинг до требуемой плотности волокон получается. Размах металлическим наконечником с бумажным полотенцем, проставленный на непроводящих стержней периодически для предотвращения засорения на конце. 4. Moating 1 После спиннинг, "Ров" electrospun образцы с помощью пипетки линии PLGA по периметру крышки скольжения. Разрешить PLGA для просушки. Это будет поддерживать выравнивание волокон во время культуры. 5. Белки покрытия Electrospun волокна и стекла контроля должны быть покрыты белком до клеточной культуры. Обложка субстратов в растворе белка, по крайней мере, один час, а затем аспират избыток раствора и продолжают аспирационных до подложки сухой. Возможные решения белка включают в себя: PLL (поли-L-лизин) (100 мкг / мл), ламинин (25 мкг / мл) или фибронектина (50 мкг / мл). Если ФАПЧ используется, поверхности должны быть промыты в стерильной воде и сушат в два раза после первого покрытия. 6. Получить E15 крысиных эмбрионов 3 * Все эксперименты были проведены в соответствии с Руководством NIH по уходу и использованию лабораторных животных утвержденного Мичиганского университета Комитета по использованию и уходу за животным. Подготовка: Убедитесь, что животное беременна. Оттепель 3 мл трипсина, 3 мл ФБС и теплая бутылка L15. Пожар польский пипетки Пастера. Лечить все хирургические инструменты в 70% этаноле в течение 30 мин. Подготовка и теплая обшивка СМИ (см. таблицу 1). Эвтаназия: Выполнение IP инъекции кетамина / ксилазина. Подождите 10-15 минут, и проверить его на отсутствие роговицы и педали вывода рефлексов. Как только рефлексы отсутствуют, выполните IC инъекции фенобарбиталом (FatalPlus). Палатка кожу живота. Вырезать через кожу и мышечные слои, чтобы разоблачить брюшной полости. Найдите матки и отделить его на шейку матки и яичников. Удалить эмбрионов из матки с помощью ножниц и место их сразу в теплую L15. (Все следующие процедуры будут завершены под микроскопом и рассекает эмбрионов и расчлененный шнуры должны быть погружен в теплую L15 во все времена.) Обезглавьте эмбриона, закрыв щипцы вокруг подбородка и ниже затылочной кости черепа. 7. Препарирование 3 Место эмбриона на одной стороне. Защита спинного мозга с одним набором щипцов, используя другой набор к полосе от конечностей и органов брюшной полости. Включите эмбриона и удерживайте его устойчивым с одним набором щипцов. Snip по длине эмбриона, от шеи до хвоста, пока весь шнур подвергается. Возьмитесь за конец шнура тщательно и вытяните ее над собой к хвосту, чтобы удалить. Шнур будет тянуть бесплатно с мембраной и спинной ганглий корня (DRG) прилагается. Если DRG эксплантов или диссоциированных сенсорных нейронов культуры должны быть выполнены, СНиП DRG от мозга и передавать их на свежий блюдо теплым L15. Для DRG эксплантов культуры, перейдите к шагу 10,2 Для диссоциированных сенсорная культура нейронов, переходите к шагу 9 Для культуры двигательных нейронов, DRG, будут удалены с мембраной в шаге 7,5 Удалить мембрану из спинного мозга, держа его в верхней части мозга и пилинг его, похоже на удаление долго носок. Повторите эти действия для всех эмбрионов, а затем нарезать на небольшие шнуры (2-3 мм) штук. <pкласс = "jove_title"> 8. Двигательных нейронов (MN) Обработка 5,6,7 Залейте нарезанные шнуры и L15 в конических и спина при 1000 оборотов в течение 2-3 мин для осаждения штук. Слейте надосадочную жидкость и добавить 3 мл трипсина в гранулированной шнуры. Инкубируйте в 37 ° С на водяной бане 20 мин. Добавьте 3 мл ФБС для конических и спина при 1000 оборотов в течение 2-3 мин повторно гранул. Слейте надосадочную и пальто огнем полированные пипетку Пастера с FBS. Добавьте одну пипетку Пастера-полно L15 для конической, а затем растирают мягко, пока решение однородной, без видимых комков. Избегайте пузырей. Подготовка 9%-ный раствор Optiprep в L15. Подготовка одну пробирку с 3 мл раствора Optiprep на каждых двух эмбрионов (если есть нечетное число эмбрионов, округлить). Оставьте гомогенизированный раствор на решение Optiprep, разделив ее поровну между всеми трубами. Спиновые труб при 2000 оборотов в минуту в течение 15 мин. Осторожно собрать топ 2 мл из каждой пробирки и бассейн в 50 мл коническую. Заполните конические с L15 и спина при 1000 оборотов в течение 5 мин для полоскания клетки Optiprep. Слейте надосадочную и ресуспендирования клеток в небольшом количестве покрытие СМИ (250-500 мкл). Граф клеток с использованием трипанового синего исключения для выявления живых клеток. Пропустить и перейти к шагу 10,1 9. Сенсорного нейрона (SN) Обработка 7 Налейте DRG удален из спинного мозга и L15 в конической трубе и спина при 1000 оборотов в течение 2-3 мин для осаждения штук. Слейте надосадочную жидкость и добавить 3 мл трипсина в гранулированной DRG. Инкубируйте в 37 ° С на водяной бане 10 мин. Добавьте 3 мл ФБС для конических и спина при 1000 оборотов в течение 2-3 мин повторно гранул. Слейте надосадочную и пальто огнем полированные пипетку Пастера с FBS. Добавьте одну пипетку Пастера-полно L15 для конической, а затем растирают мягко, пока решение однородной, без видимых комков. Избегайте пузырей. Спиновые гомогената при 1000 оборотов в минуту в течение 5 мин. Слейте надосадочную и ресуспендирования клеток в небольшом количестве SN покрытие СМИ (250-500 мкл). Граф клеток с использованием трипанового синего исключения для выявления живых клеток. Перейдите к шагу 10,1 10. Покрытие и культуры Для диссоциированных С. Н. или М. Н. культуры: Обложка подложках с несколькими каплями медиа затем добавить соответствующий объем клеточной суспензии. Расхождение между клетки должны быть покрыты при низкой плотности (25-50 кл / мм 2). Разрешить клетки придерживаться, по крайней мере за один час до затопления скважин со СМИ. Для DRG эксплантов культуры: Обложка подложках с несколькими каплями медиа затем добавить DRG, чтобы средства массовой информации. Упорядочить DRG, чтобы они равномерно распределены по всей подложке (около 4 DRG может поместиться на 22×22 скольжения крышки мм). Разрешить DRG придерживаться, по крайней мере, 4 часа до затопления скважин со СМИ. Культуры могут быть сохранены на срок до 4 дней без изменения информации. Для более длинных культур, половина средств массовой информации изменений должно быть сделано с кормом СМИ. Поток средств массовой информации является тот же состав, покрытие СМИ минус L-глутамина. 11. Иммуноцитохимическая 1,5,8 Крепление клеток: Аспирируйте СМИ и заменить теплым 4% PFA (параформальдегид) в течение 30 мин. Затем выполните 3X 5 мин 1x PBS стирок. Блокировка / пермеабилизации: Подготовьте блок / Пермь решение (1,25% бычьего сывороточного альбумина в 1X PBS, 0,05% Тритон Х-100 и 2,0% нормальной козьей сывороткой). Аспирируйте PBS и применить блок / Пермь решение образцов в течение 30 минут. Затем выполните 1X 5 мин 1x PBS стирок. Первичное антитело: Подготовка первичных антител рабочего раствора (10% нормальной козьей сывороткой, 1,25% бычьего сывороточного альбумина, 0,1% Na азид, 0,05% Тритон Х-100 и до 10 мл с 1x PBS). Добавить необходимое количество первичных антител (см. таблицу 2). Линия несколько блюд с парафильмом. Место шарик 200 мкл первичных антител решение о парафильмом для каждой подложке. Обратить субстратов, плавучие их ячейки вниз на первичных антител рабочего раствора на ночь (если в комнате есть кондиционер или особенно сухой, часть воды, насыщенной бумаги могут быть добавлены в углу блюдо для предотвращения испарения рабочего раствора) . Вторичные антитела: Удаление подложки из первичных (рабочий раствор может быть собрана, хранить при температуре 4 ° С и использовать повторно) и выполнять 2X 5 мин 1x PBS стирок. Применить 200 мкл разбавленного вторичные антитела 1:200 в PBS (также обращена на парафильмом выстроились блюдо) в течение 4 часов. Удалить из вторичного затем выполнить 2X 5 мин 1x PBS стирок. Горы субстратов на слайдах с Продли Золотой содержащей DAPI или другой подходящий ответного ядерного пятно. 12. Представитель Результаты: Типичная морфология выровнены и случайных эльectrospun волокна показано на рисунке 1. Как правило, мы получаем MN чистоты> 90% нейронов 7,8 с этим протоколом, и мы сохранили DRG культур тех пор, пока одна неделя без какого-либо значительного роста фибробластов. На рисунке 2 показан типичный вид MN на стекле и волокон после 24 часов культуры и иммунной окраски. Immunostained DRG культивировали в течение трех дней на стекле и волокна изображено на рисунке 3. Рисунок 1. Волоконно выравнивание манипулировать выбором коллектора. А.) неприсоединения волокна нити на вращающуюся коллектор колесо и б) случайные волокна нити на стационарный коллектор пластины. Шкала баров = 20 мкм. Рисунок 2. Представителем моторных нейронов окрашивают в течение TuJ1 (зеленый) и DAPI (синий), после 24 часов культуры на PLL покрытием А.) волокон и б) стекла. Шкала баров = 20 мкм. Рисунок 3. Представитель DRG окрашивают в течение нейрофиламентов (зеленый) после 3 дней культуры на PLL покрытием А.) стекла и б) волокон. Шкала бар = 200 мкм. Маточного раствора: М. Н. СМИ: DRG / SN СМИ: 10 мг мл -1 альбумина 12,5 мкл – 10 мг мл -1 апо-трансферрина 50 мкл 40 мкл 50 мкг мл -1 β-эстрадиола 2,7 мкл 2,2 мкл 0,1 мг мл -1 биотин 50 мкл – 16 мг мл -1 каталазы 8 мкл – 15 мг мл -1 D-галактозы 50 мкл – 50 мкг мл -1 гидрокортизон 3,7 мкл 2,9 мкл 0,63 мг мл -1 прогестерона 0,5 мкл – 16 мг мл -1 путресцин 50 мкл – 50 мкг селена мл -1 3,4 мкл 4,1 мкл 2,5 мг мл -1 супероксиддисмутазы 50 мкл – * 500 нг мл -1 фактора роста нервов – 1 мл * 100X PSN 0,5 мл 0,5 мл * B27 1 мл 1 мл * 2 мМ L-глутамина 35 мкл 35 мкл * Neurobasal до 50 мл до 50 мл Таблица 1. Добавить снялся (*) компонентов в СМИ непосредственно перед использованием. Остальные компоненты могут быть подготовлены в качестве исходного раствора и выдерживают при температуре -20 ° С до необходимых 6,7. Первичные (концентрации) Нейроны: Глия: Фибробласты: анти-β-тубулина (TuJ1) (1:1000) ✓ X X анти-нейрофиламентов (1:1000) ✓ X X анти-S-100 (1:250) X ✓ ✓ анти-NGFR p75 (1:500) ✓ ✓ X Таблица 2. Отбор первичных антител зависит от целей исследователя. Выше несколько антител и концентрации мы с успехом использоваться в нашей лаборатории. S-100 особенно полезен для выявления Шванн клеток и / или проверки загрязнения фибробластов, но учтите, что она должна использоваться в сочетании с NGFR p75 различать глии и fibroblasts4. Мы также заметили, что NGFR p75 пятна нейритов очень легко в то время как нейрофиламентов или TuJ1 являются отличным выбором, если цель заключается в визуализации отдельных невриты.