תעתיקי רנ"א כפופים תקנה posttranscriptional נרחב כי הוא מתווך על ידי מספר רב של טרנס משחק RNA מחייב חלבונים (RBPs). כאן אנו מציגים שיטה להכליל לזהות במדויק בקנה מידה רחב transcriptome האתרים RNA מחייב של RBPs.
תעתיקי רנ"א כפופים לרגולציה שלאחר תעתיק הגן על ידי אינטראקציה עם מאות RNA מחייב חלבונים (RBPs) ו microRNA המכילים קומפלקסים ribonucleoprotein (miRNPs), אשר באים לידי ביטוי לעתים קרובות סוג תא dependently. כדי להבין כיצד יחסי הגומלין הללו RNA מחייב גורמים משפיעים על ויסות תעתיקי אדם, מפות ברזולוציה גבוהה של חלבון in vivo-RNA אינטראקציות הכרחיים 1.
שילוב של גישות גנטיים ביוכימיים חישוביים מיושמים בדרך כלל לזהות RNA-RBP או RNA-RNP אינטראקציות. פרופיל microarray של RNAs הקשורים RBPs immunopurified (RIP-Chip) 2 מגדיר מטרות ברמה transcriptome, אבל היישום שלה מוגבל אפיון של אינטראקציות יציב kinetically ורק במקרים נדירים 3,4 מאפשר לזהות את מרכיב ההכרה RBP (RRE ) בתוך RNA היעד ארוך. עוד יעד ישיר RBP המידע באתר מתקבל על ידי שילוב של crosslinking UV vivo 5,6 עם immunoprecipitation 7-9 ואחריו הבידוד של crosslinked קטעי RNA ו רצפי cDNA (קליפ) 10. CLIP היה להשתמש בו כדי לזהות מטרות של מספר RBPs 11-17. עם זאת, CLIP הוא מוגבל על ידי היעילות הנמוכה של crosslinking UV 254 ננומטר RNA-חלבון, את המיקום של crosslink אינו לזיהוי בקלות בתוך שברי crosslinked רצף, ולכן קשה להפריד UV-crosslinked פלחי יעד RNA מרקע שאינו crosslinked RNA שברי נוכחת גם במדגם.
פיתחנו גישה חזקה מבוססי תאים crosslinking לקבוע ברזולוציה גבוהה transcriptome רחב של אתרי הקישור RBPs ו miRNPs הסלולר שאנחנו המונח PAR-Clip (Photoactivatable-Ribonucleoside משופרת Crosslinking ו immunoprecipitation) (ראה איור. 1A עבור מתאר של השיטה). השיטה מסתמכת על שילוב של אנלוגים ribonucleoside photoreactive, כגון 4-thiouridine (4-SU) ו – 6-thioguanosine (6-SG) לתוך המתהווה תעתיקי רנ"א על ידי תאים חיים. הקרנה של תאים על ידי אור UV של 365 ננומטר גורמת crosslinking יעיל של nucleoside שכותרתו RNAs photoreactive הסלולר RBPs אינטראקציה. Immunoprecipitation של RBP ריבית מלווה הבידוד של RNA crosslinked ו coimmunoprecipitated. RNA בודד מומר ספריית cDNA ו רצף עמוק באמצעות טכנולוגיית Solexa. אחד המאפיינים של ספריות cDNA שהוכן על ידי Clip-PAR היא כי מיקום מדויק של crosslinking ניתן לזהות על ידי מוטציות המתגוררים רצף cDNA. בעת שימוש 4-SU, רצפים crosslinked thymidine המעבר cytidine, ואילו באמצעות 6-SG תוצאות guanosine כדי אדנוזין מוטציות. הנוכחות של מוטציות ברצפי crosslinked מאפשרת להפריד אותם מהרקע של רצפי נגזר RNAs הסלולר בשפע.
יישום השיטה למספר מגוונים חלבונים RNA מחייב דווח Hafner et al. 18
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים לחברי במעבדה Tuschl לדיונים מועילים. MH נתמך על ידי Akademischer דויטשר Austauschdienst (DAAD). עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית השוויצרית גרנט # 3100A0 114,001 ל-MZ: TT הוא חוקר HHMI, ולעבוד במעבדה שלו נתמך על ידי NIH מענקים GM073047 ו MH08442 וקרן סטאר.
Buffers and reagents
Growth medium HEK293 cells
4-thiouridine stock solution (1 M)
Doxycyclin stock (10 mg/ml)
1x NP40 lysis buffer
Prepare a stock of 5x buffer without DTT and protease inhibitors. Add DTT and protease inhibitor directly before the experiment.
Citrate-Phosphate buffer
IP-wash buffer
High-salt wash buffer
Dephosphorylation buffer
Phosphatase wash buffer
Polynucleotide kinase (PNK) buffer without DTT
PNK buffer
SDS PAGE loading buffer
2x Proteinase K buffer