SDS-PAGE/Immunoblot الكشف عن Multimers Aβ في الأنسجة البشرية القشرية الخليط باستخدام مستضد استرجاع حاتمة
Summary
وصفنا تقنية لإعداد الخليط أوضح القشرية الإنسان ، وفصل البروتين SDS – PAGE ، واسترجاع مستضد immunoblotting مع الضد إلى الببتيد Aβ. باستخدام هذا البروتوكول ، ونحن باستمرار اكتشاف Aβ موحودي multimeric في الأنسجة والقشرية من البشر مع أمراض الزهايمر.
Abstract
للطي الشاذ والبلمرة من اميلويد β (Aβ) يعتقد الببتيد للشروع في تعاقب الاعصاب في التسبب بمرض الزهايمر<sup> 1</sup>. Aβ هي في الغالب ما بين 40 — الببتيد حمض أميني أو 42 ، وهذا هو عرضة للتجميع الذاتي في β ورقة الغنية ييفات اميلويد التي تم العثور عليها في عينات من لويحات خرف الدماغ في مرض الزهايمر. أدلة متزايدة تشير إلى أن انخفاض الوزن الجزيئي ، multimers Aβ ذوبان أكثر سمية من اميلويد Aβ ييفي<sup> 2</sup>. تحديد وتقدير حجم الأنواع الوزن Aβ multimeric المنخفضة والعالية الجزيئية في أنسجة الدماغ هو هدف أساسي في مجال أمراض الزهايمر ، ويمكن تطبيق الأساليب المستخدمة أيضا إلى تحديد وتوصيف multimers السامة في proteopathies أخرى<sup> 3</sup>. ويمكن الكشف عن multimers Aβ طبيعيا بواسطة SDS – الكهربائي للهلام بولي أكريلاميد تليها immunoblotting مع Aβ محددة الأجسام المضادة. ومع ذلك ، فإن الانفصال وكشف Aβ multimeric يتطلب استخدام الخليط القشرية عالية التركيز واسترجاع صغيرة في الأغشية مستضد النيتروسليلوز مسام الحجم. نحن هنا وصف الأسلوب لإعداد الخليط أوضح القشرية الإنسان ، والفصل بين البروتينات التي SDS – PAGE ، ومستضد حاتمة استرجاع / النشاف الغربية مع 6E10 الضد إلى المنطقة N – محطة من الببتيد Aβ. باستخدام هذا البروتوكول ، ونحن باستمرار اكتشاف مونومرات Aβ ، dimers ، trimers ، tetramers ، وارتفاع الوزن الجزيئي multimers في الأنسجة القشرية من البشر مع أمراض الزهايمر.
Protocol
Discussion
على الرغم من أهمية تجميع Aβ في التسبب في مرض الزهايمر 1،4،5 ، وقد وصفت دراسات قليلة كميا أو توزيع multimers Aβ متنوعة في عينات الأنسجة البشرية القشرية 2. المناعى التقنيات استخداما لا تسمح للتمييز من الأنواع المتميزة Aβ multimeric في الأنسجة القشرية الثابتة. الخليط غير…
Acknowledgements
شكرا جزيلا لPranski الين وكارولين Suwyn للحصول على المساعدة التقنية الممتازة وهاري ليفين إلى الثالث ، M. بول ميرفي ، ومارلا التسخير لإجراء محادثات هامة. وقدم التمويل RR – 00165 ، PO1AG026423 ، P50AG025688 ، AG030539 ، ومؤسسة وودروف وجامعة إيموري جنة البحوث.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Santa Cruz Biotechnology | Sc-29130 | 1 tablet in 25ml buffer | |
| BCA Protein Assay kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | ||
| XCell SureLock Mini-Cell and XCell II Blot Module Kit CE Mark | Invitrogen | EI0002 | ||
| Novex Tricine SDS Sample Buffer (2X) | Invitrogen | LC1676 | ||
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10X) | Invitrogen | NP0004 | ||
| SeeBlue Plus2 Pre-Stained Standard | Invitrogen | LC5925 | ||
| Novex 10-20% Tricine Gel 1.0 mm, 10 well | Invitrogen | EC6625BOX | ||
| Nitrocellulose membranes, 0.2 μm pore size | Invitrogen | LC2000 | ||
| Novex Tricine SDS Running Buffer (10X) | Invitrogen | LC1675 | ||
| Novex Tris-Glycine Transfer Buffer (25X) | Invitrogen | LC3675 | ||
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | Will not interfere with immunostaining | |
| ATX Ponceau S Red staining solution | Sigma Aldrich | 09276 | Will not interfere with immunostaining | |
| Kapak heat sealable plastic sample pouches | Fisher Scientific | 0181225AA | ||
| 6E10 mouse monoclonal antibody to Aβ(1-16) | Covance | SIG-39320 | Dilute 1:1,000 up to 1:5,000 for WB | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P2287 | ||
| ECL Mouse IgG, HRP-Linked Whole Aβ (from sheep) | GE Healthcare Life Sciences | NA931-1ML | Dilute at 1:10,000 | |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | ThermoFisher | 34077 | ||
| Kodak Biomax MR Film | Carestream Health | 870 1302 |
References
- Hardy, J., Selkoe, D. J. The amyloid hypothesis of Alzheimer’s disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science. 297, 353-356 (2002).
- Haass, C., Selkoe, D. J. Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessons from the Alzheimer’s amyloid beta-peptide. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 8, 101-112 (2007).
- Walker, L. C., LeVine, H. The cerebral proteopathies. Neurobiol. Aging. 21, 559-561 (2000).
- Selkoe, D. J. Aging, amyloid, and Alzheimer’s disease: a perspective in honor. of Carl Cotman. Neurochem. Res. 28, 1705-1713 (2003).
- Walsh, D. M., Selkoe, D. J. Abeta oligomers – a decade of discovery. J. Neurochem. 101, 1172-1184 (2007).
- Swerdlow, P. S., Finley, D., Varshavsky, A. Enhancement of immunoblot sensitivity by heating of hydrated filters. Anal. Biochem. 156, 147-153 (1986).
- Ida, N., Hartmann, T., Pantel, J., Schröder, J., Zerfass, R., Förstl, H., Sandbrink, R., Masters, C. L., Beyreuther, K. Analysis of hetergeneous A4 peptides in human cerebrospinal fuid and blood by a newly developed sensitive Western blot assay. J. Biol. Chem. 271, 22908-22914 (1996).
