Giriş Kabuklu nöromüsküler kavşak, fizyoloji ve yıllar boyunca, özellikle sinaptik fizyolojisi için önemli katkılar sağladı. Diseksiyon ve canlılığı kolaylığı muhtemelen deneysel hazırlıkları gibi kabuklular kullanmak için erken anatomist ve daha sonra fizyolog terfi önemli faktörlerdir. Özellikle Kerevit en tatlı, akarsu ve göller gibi soğuk, tuzlu su ortamı gerektiren kabuklular ile karşılaştırıldığında bir laboratuar ortamında bakımı kolay kolay elde edilebilir. 1800'lerin sonuna doğru bir zoolog kalp özellikle kabuklu türleri (yani, crayfishes) aldı ve başlıklı bir kitap yazdı Kerevit ( TH Huxley , 1879). Bu metin, yıllardır bu organizmalar üzerinde rehber kitap olarak görev yaptı ve bugün hala yaşam öyküsü, anatomi ve fizyoloji ile ilgili crayfishes seçici kapsamlı bir kitap olarak selamlandı. Huxley tüm yönleriyle zooloji derinliklerine dalmak için bir model hayvan olarak kerevit izlenmiş, bu yüzden kitabın kapsamlı bir doğa. Fizyoloji geç 1880 Ringer, kurbağa kalbi preparatları (Ringer, 1882a, b) korumak için gerekli iyonların anlayışı ile çiçeklenme zamanlama avantajlı oldu. Bu büyük olasılıkla fizyolojik deneyler kerevit gibi diğer türlerin yanı sıra hızla ilerledi ki bir nedeni budur. Ayrıca tuzlu, kabuklu hazırlıklarını sürdürmek için 1936 yılında kamyonet Harreveld tarafından tarif edilmişti. Şaşırtıcı kerevit bacaklarda açıcı kas innervasyonu aynı zamanda tarihin bu sefer (Biedermann, 1887) etrafında karakterize ediliyordu. Ama daha da şaşırtıcı fizyolojik çalışmalar zaten Fransa'da Charles Richet'nin tarafından kerevit kasları devam edildi. Aslında, kerevit deneyler muhtemelen nöromüsküler (NMJ) (ayrıca bkz. Richet'nin, 1881 Richet'nin, 1879) kolaylaştırma gösteren ilk olabilir. Önümüzdeki birkaç on yıl içinde kerevit NMJs gerginlik geliştirme ve anatomi (Van Harreveld ve Wiersma, 1936) ile ilgili anatomik ve fizyolojik olarak tarif ediliyordu. Alanında farklı soru setleri adresine canlanmış keskin elektrotlar (Ling ve Gerard, 1949), hücre içi kayıt gelişi. Kabuklu kasları (Katz, 1949; Katz & Kuffler 1946 Wiersma, 1949) kademeli kasılmaları üretmek için bilinen, ancak 1953 yılına kadar Fatt ve Katz yengeç kas lifleri kısa vadeli kolaylaştırma transmembran potansiyelleri kaydedilen değildi. Dudel ve bu kas Kuffler kolaylaştırma gösterdi ve 1. kez ortaya çıktığında, kerevit, bacaklarda açıcı kas 1961 yılında tekrar vurgulandı presinaptik inhibisyon fenomenler (1961a, b; Dudel, 1963, 1965a) . Ayrıca bu NMJ (1961b) sinaptik iletim quantal doğa bildirdi. Son 50 yıl içinde hazırlanması ve sinaptik fizyolojisi izlemek için kullanılan çeşitli teknikler verilen ilgi biraz olmuştur. Bu preparatın kullanan araştırmaların kısa bir görüntüsü üzerinde, tüm kas bir eksitatör ve seçici teşvik olabilir inhibitör akson tarafından innerve olduğunu belirterek ile başlar. Atwood (1964), eksitatör postsinaptik potansiyelleri, kas gerginliği kolaylaştırdı ve üretilen stimülasyon tren ile gösterdi. Iravani (1965), kas bölgeye bağlı olarak sinaptik yanıtları bölgesel farklılıklar bildirdi. Kısa bir süre sonra Dudel (1965a, b) açacağı sinir terminallerine boyunca potansiyeller kaydedilmiş ve nöromodülatör serotonin gelişmiş artırarak sinaptik iletim quantal içerik demek olduğunu göstermiştir. Bu zamana kadar kabuklu kasların çeşitli amino asitler gibi GABA glutamat ve cevap verdiğini kurulmuştur (Van Harreveld ve Mendelson, 1959; Robbins, 1959; Kerkut ve ark, 1965). GABA inhibitör yanıtlar Florey (Bazemore ve ark, 1956, 1957) ve diğerleri (Boistel ve Fatt, 1958) tarafından tespit edilmiştir. Daha sonra GABA Kravtiz (Kravitz ve Potter, 1965 Kravitz, 1962; Kravitz ve ark, 1963a, b) tarafından izole edilmiş ve teyit edilmiştir ıstakoz açıcı preparatlar aksonlar. Kerevit kaslar kolay erişilebilir hazırlıkları sadece teklif edildi ama bir tanımlanabilir motor nöronların fizyolojik ve yapısal düzeyde çeşitli postsinaptik tepkiler nasıl tek bir neden olabilir dersleri veriyor. Özellikle açıcı kas, tek bir eksitatör motor nöron tarafından innerve, ancak farklı yerlerde eksitatör postsinaptik potansiyelleri (EPSPS), dorsal yüzeysel lifleri 50 kat (Bittner, 1968a, b) üzerinde değişiklik ve ventral yüzeysel kadar 8 kat. lifler (Iravani, 1965). "> Ile seminal kerevit açacağı NMJ kısa vadeli kolaylaştırma yanı sıra, uzun vadeli kolaylaştırma (LTF) (Sherman ve Atwood, 1971) ortaya koyduğu keşfetmek, bir tarafı olarak ele alınması gereken bu olayların mekanistik temellerinin. not, uzun vadeli potansiyasyonu (LTP) (Bliss ve L mo, 1973) kerevit NMJ olgusunun keşfi kaynak gösterilmeden omurgalı beynin iki yıl sonra keşfedildi. öznitelikleri odaklanmış birçok araştırmacılar, bu dönemden Atwood ve ark, 1994;. Zucker, 1973, 1974a, b; Bittner ve Sewell, 1976; Parnas ve ark, STF ve LTF hücresel mekanizmaları (Atwood, 1973, 1976, 1982 çalışma kerevitler açıcı NMJ 1982a, b, c, d; Dudel ve ark, 1983;. Vyshedskiy ve Lin, 1997a, b, c) Ayrıca açıcı kas çeşitli kas lifleri innerve tek bir motor nöron nasıl ortaya çıkmasına neden olabilir anlamak için bir odak noktası olmuştur gibi çeşitli sinaptik yanıtları (Linder, 1974; G ¨ nzel ve ark, 1993; Govind ve ark, 1994; Iravani, 1965; Atwood, 1967; Bittner, 1968a, b; Sherman ve Atwood, 1972; Zucker, 1974a; Parnas ve ark, 1982a; Zucker ve Haydon, 1988; Dudel, 1989a, b, c, d). Diferansiyel sinaptik tepkileri hesaba Synaptic yapı ultrastrüktürel analizi (Jahromi ve Atwood, 1974) ile araştırılmalıdır. Aktivite nedeniyle iyonik farklılıklar önlemler Ca2 + ve Na + göstergelerin yanı sıra Ca2 + tamponlar (. Mulkey ve Zucker 1993; Winslow et al, 2002) aksonal enjeksiyonları ile araştırıldı olması için mümkün olan, ve bu akıları (Winslow terminal içinde modellenmiş olması. ve ark, 1994; Cooper ve ark, 1996b). Aktivitesi bağımlı uyarlamalar (Atwood ve ark, 1991) ve farmakolojik nöromodülatör reseptör alt tiplerinin (Dropic ve ark, 2005 belirlenmesi;. Ruffner ve ark, 1999; Sparks ve Cooper, 2004; kıvılcımlar ve ark, 2004; Tabor ve Cooper , 2002) etkisi sinaptik vezikül havuzları ve kinetiği (Logsdon ve ark, 2005; Southard ve ark, 2000;. kıvılcımlar ve ark, 2003) de ele alınması, yeni sorulara yol açmaktadır incelenmiştir . STF karşı açacağı NMJ sinaptik iletim membran depolarizasyon sırasında kalsiyum rolü kavramları görüşüne göre bazı farklılıklar (Hochner ve ark, 1989 Mulkey ve Zucker, 1991) yol açar. Sinaptik gücü ve tek motor nöron kolaylaştırma, bölgesel farklılaşma, nispeten yakın zamanda ele alınması ve yerel presinaptik sinaptik yapısı değişiklikleri ve fizyoloji (Atwood ve ark, 1994 farklılıklar nedeniyle görünür olmuştur. Atwood ve Cooper, 1995, 1996a , b; Cooper ve ark, 1995b, 1996a, b). Elektron mikrografik çalışmalar ultrastrüktürel analizi varisler sinaptik bağlantıları çoğunluğu (Cooper ve ark, 1995b Florey ve Cahill, 1982) içerdiğini göstermiştir. Sinaptik yapısı (; Govind ve ark, 1994 Cooper ve ark, 1996a) karmaşıklığı nedeniyle, tek bir terminal uzunluğu boyunca sinaptik iletim gücü azalır. Sinaptik yapısında farklılıklar olabilir Ca2 farklılıkları + akını stimülasyon sırasında çeşitli frekanslarda (Cooper ve ark, 1995b, 1996b) açıklar. Açıcı kas lifleri arasında kas fenotip ve biyokimya bölgesel farklılıklar vardır (G ¨ nzel ve ark, 1993; Mykles ve ark, 2002) bu yana bölgeye ayrılmıştır, gelişimsel düzenlenir kas fenotip açıklayabilir etkiler ve motor nöron (Mykles ve ark, 2002) bölgesel farklılıkları korur. Retrograd etkilerin fikir ıstakoz (Katz ve ark, 1993), kurbağa iskelet kası (Nudell ve Grinnell, 1983) incelenmiştir ve kerevit (Lnenicka ve Mellon, 1983) makul ikna edici bir kanıt. Olmuştur Terminalleri birbirinden mesafe 1cm den 10cm ölçebilirsiniz çünkü diğer terminaller etkileyen olmadan tek bir nöron terminalleri yerel düzenlemelere kabuklu motor nöronların mekansal oldukça mümkündür. Omurgalıların aksine, bir motor ünitesi de daha o bir omurgasızlar kas (Atwood, 1973 tarafından gözden). Tüm açıcı kas innervates excitor motor nöron da daha proksimal bacak segmentinde sedye kas innervates. Açıcı kas kas lifleri arasında Kolaylaştırma ölçümleri Ca2 istirahat düzeyleri ile ilişkili olabilir farklılıklar işbirliği muhtemelen sürüm + iyonları (Cooper ve ark, 2005b) ve / veya (Parnas ve ark. 1982a, b) olduğunu gösterdi Yapısal karmaşıklığı açıcı kas terminalleri boyunca yüksek ve düşük-çıkış sinaps arasında farklılıklar acti alımı için saygı quantal imzalar için araştırıldıSTF sırasında sinaps arasında bölgeleri ve ancak bunun zor olduğu kanıtlanmıştır tespit (Lancaster ve ark, 2007; Viele ve ark, 2003, 2006). Sparks ve Cooper, 2004; yüksek ve düşük çıkış sinaps arasında veziküller Olası havuzları neromodulators düşük ve yüksek-çıkış terminalleri (Logsdon ve ark, 2005 ayırıcı etkileri var bilindiği gibi kinetik farklı düzenlenir ispat edecektir; Cooper ve ark, 2003). 50 veya 100 yıl önce olduğu gibi gelecekte kullanmak kerevit açacağı kas hazırlık açısından oldukça zengindir. Hazırlanması diğer pek çok sinaptik hazırlıkları ile kıyaslandığında hala çok cesur. Quantal tepkiler olabilir elektrofizyolojik yanı sıra, iyi tanımlanmış terminalleri çeşitli türleri vezikül dinamikleri görüntülü olarak sinaptik kişileri doğrudan kaydedildi. Hazırlık eksitatör ve inhibitör girişler için tanımlanabilen tek sinir hücresine sahip cazibesini kaybetmiş değil. Kerevit genetik manipülasyon için pratik olmama rağmen, çalışmalar Drosophila gibi sinaptik proteinlerin rolünü ele almak mümkündür. (O arkadaşları ve ark, 1999). Protein enjeksiyon çalışmaları ile incelenebilir Drosophila NMJs (Atwood ve Cooper, 1995, 1996a, b) sinaptik fonksiyon pek çok benzerlikler vardır. Birçok açıklamak; motor sinir terminalleri içinde sinaptik vezikül havuzları düzenleme STF sırasında kalsiyum düzenlemesi (Desai-Şah ve Cooper, 2009. Desai Shah ve ark, 2008) anlamak için de gelecekte soruşturma yanı sıra mekanik çalışmalar için zengin bir alandır sinaptik iletim temelleri kalan gizemleri. Yöntemleri Diseksiyon 6-10 cm, vücut uzunluğu ölçme Kerevit, Procambarus clarkii (Atchafalaya Biyolojik Supply Co, Raceland, LA), zorla ischiopodite segmentinde kısma birinci veya ikinci yürüyüş bacak otomatikleştiren ikna edilir. Biri dışında (lateral tarafı) diseksiyonu plaka üzerinde yukarı baktığından emin olabilirsiniz kadar etrafında bacak açın. Bu genellikle kemerli bir tarafı. Bir parça kağıt mendil bacak yerleştirilmesi bu indirimler yaparken hazırlık kolaylıkla açılabilir yardımcı olur. Bir neşter bıçak kesici ve tutucu ile keskin bir jilet, meropodite segment için bu rakam gösterilen desen ile kesme kadar manikür dağlamadan için kullanılır. Carpopodite eklem – Bakım meropodite ventral kesmek kadar dorsal distal kesmek için kullanılması gerekir. Şimdi bir yerde manikür bırakın. Propodite manikür etch jilet neşter bıçağı ile sadece proksimal keser katılan diğer tarafta tekrarlayın bir tarafta propodite segment için yukarıdaki resimde gösterilen desen kesme ve kadar. Bakım açıcı kas içine kesmek için kullanılması gerekir. Bu bıçak manikür keserken yakın kas eğilerek tutarak yapılabilir. Ayrıca ventral kesmek için dorsal, ventral tarafta etrafında bağlayan, çok dar ve kolay kırılan ortak bağlantı olarak proksimal kesmek için dikkatli olun. Şimdi bir yerde manikür bırakın. Hazırlıkları tuzlu su içine konulmalıdır. Bu diseksiyon çanak alt Sylgard (Dow Corning) kaplama (1cm kalınlığında) olmalıdır. Sylgard böcek pimleri hala hazırlık tutmak için içine sıkışmış olabilir kullanılır. Bu noktada meropodite yapılan pencere, kesim içinde, dorsal kaudal köşesinde bir pin sopa. (# 5) distal ucu ince cımbız ile manikür hafifçe kaldırın ve ustura ile, distal proksimal şekilde kesim fleksör kas lifleri kesmek, manikür dan uzakta. Manikür off pencere kaldırın. Carpopodite eklem (aşağıda gösterilen) – Şimdi meropodite apodeme (tendon) kesti. Kesim yapmadan önce bacak boşluğu uzak tendon çekin ve sadece tendon ve tendon iç tarafında ana bacak sinir kesmek için çok dikkatli olun. Cımbız ile kesildi tendon Pinch fleksör kas ve kaudal yönde çekerek koparmak. Şimdi ana bacak sinir ve ekstansör kas maruz kalmaktadır. Propodite segment geçin ve şimdi propodite dactylop kesilmişeklem odite. Burada yakın tendon, belki de manikür eki kesilmiş. Kaudal bölgede bağlı kas görülebilmesi için, aşağı ve geri kaudal propodite ventral (yakın kas tarafı) segmentinde çekin. Jilet ile bu kaslar kesin. Açıcı kas motor sinir dalı kesme eklem ve risk çok yakın kas kesmek için dikkatli olun. Açıcı kas tuzlu maruz kalmaktadır. Eksitatör ve inhibitör motor nöron içeren açıcı kas sinir demetleri izole etmek için meropodite bölgeye dönün. Meropodite segmentinin en kaudal bölgede bacak sinir demeti genellikle ayrı bir sinir demeti içerir. Dorsal demet ince makas olabilir transeksiyon iki demetleri görülebileceği Bu kısa bir bölgedir. # 5 cımbız ile kesim sonunda yakalandı ve yaklaşık yarısı meropodite segment uzunluğu ulaşılana kadar yavaşça distalde çekti. Bu uzun sinir dalı eksitatör açıcı sinir içerir ve sinirlerin daha büyük bir paket açacağı kas inhibitör motor nöron içerir. Meropodite segmentinde hazırlanması artık bir böcek pin meropodite dorsal ile konabilir böyle bir çapraz şekilde kesilir. Bu gözlemci (aşağıda gösterildiği gibi) karşı karşıya olduğu açıcı kas ventral konumlandırır. Blokları bakış açıcı kas propodite boşluğunun manikür ve dışarı karşı lifler basarak silinebilir, yakın kas kalan lifleri. Bazen bir bağ dokusu dikkatle # 5 cımbız kullanarak silinebilir açıcı kapsar. Açıcı kas boyunca uzanan ve dactylopodite gider ana bacak sinir dactylopodite ortak ya da sadece ince cımbız ile çekti başlangıç ya da kesilebilir. Bu ana bacak sinir ve bazen açık ilişkili kan damarı açıcı kas uzunluğu için bir proksimal yönde hafifçe çekilebilir ve daha sonra kesip. Şimdi açıcı kas doku, hücre içi bir elektrot veya odak macropatch elektrot şekilde almak için herhangi bir olmadan maruz kalmaktadır. Eksitatör sinir açıcı kas uyarmak amacıyla hazırlanması artık bir plastik emme elektrot ile tasarlanmış bir kayıt odasına taşınır. Odasına inşa uyarıcı elektrot uyarıcı elektrot yerleştirmek için bir micromanipulator kullanmak zorunda önler. Kayıt çanak hazırlık Pin ve eksitatör sinir emme elektrot içeren sinir dalı yere. (Alınan Mykles, DL, Medler, SA, Koenders, A., ve Cooper, RL (2002) Myofibrillar protein izoform ifade kerevit ve istakoz pençe ve bacak açıcı kasları yavaş lifler sinaptik etkinliği ile ilişkili Dergisi. Deneysel Biyoloji 205 (4): 513-522). Tuzlu (5.3 KCl 13.5 CaCl2.2H2O 2.45 MgCl2.6H2O; pH 7.4 'e ayarlanmış 5 Hepes 205 NaCl mM) Dissected hazırlıkları kerevit serum fizyolojik, modifiye Van Harreveld çözümü korunur. Kayıt intrasellüler EPSPS Uyarılmış bir yanıt ortaya çıkarmak için, eksitatör akson seçici bir Çim stimülatörü tarafından uyarılır. Açıcı kas bir bölge, 3 M KCl ile dolu, keskin intrasellüler elektrot (20 ila 30 mOhm direnci) kazığa. Standart bir kafa sahne ve amplifikatör hücre içi kayıt için kullanılabilir; ancak biz (Moleküler Aygıtlar, Sunnyvale, CA, USA) bir model 2B Axonclamp amplifikatör ve 1 X LU baş sahne. Kısa vadeli kolaylaştırma (STF) veya istenilen yanıtları çeşitli tip uyaran değişen elde edilebilir. STF eksitatör sinir, bir tren, sırasıyla 10 veya 20 saniyelik aralıklarla, 10 veya 20 bakliyat vererek elde edilir. Tren içinde stimülasyon frekansı (40, 60 ve 80 Hz) çeşitli olabilir. Intracellular EPSP kayıtları, bu standart prosedürler rutin yapılmaktadır (Crider & Cooper, 1999, 2000; Cooper ve ark 1995b; Dudel, 1983; Sparks ve Cooper, 2004; Desai-Şah ve Cooper, 2009) . Merkezi, distal ve proksimal: açıcı kas genel olarak üç bölgeye ayrılmıştır. Tüm açık kas tek bir motor nöron tarafından innerve olmasına rağmen, NMJs yapısal olarak farklıdır ve bu üç genel bölgeler (Cooper ve ark. 1995a, b) sinaptik etkinliği bölgesel farklılıklar var. Kas lifi fenotipi türü de (Mykles ve ark 2002) bu bölgelerde farklı olduğu gösterilmiştir. Bu nedenlerden ötürü, kolayca hazırlıkları arasında tutarlılık olarak belirli beri en distal lifler kullanılır. Doğrudan sinir terminal tanımlanabilir bölgeler üzerinde odak quantal EPSPS Kaydı Sinaptik varisler (5 mcM, 5 dakikalık tedavi, Cooper ve ark, istihdam edilen konsantrasyonlarda ve zaman zaman, sinaptik iletim etkilemez hayati boya 4-Di-2-Asp (Magrassi ve ark, 1987) ile görüntülendi . , 1995b). Floresan mikroskobu ile lümen, bir makro-yama kayıt elektrot (Cooper ve ark, 1995c. St ¨ hmer ve ark, 1983) tek bir izole varisler üzerinde doğrudan yerleştirilmiş olabilir. Sinir terminali uyandırmak için, yukarıda da belirtildiği gibi eksitatör motor sinir uyarılır. Spontan yanı sıra uyarılmış quantal yanıtları yavaşça lümen düşürücü ve her varisler üzerine yükselterek, görüntülenmiştir varisler dize boyunca kaydedilebilir. Sinaptik potansiyeller, esas olarak, 1981 Dudel tarafından açıklanan bir makro-yama elektrot ile kaydedilir Wojtowicz ve ark . (1991) ve Mallart (1993). Kimax cam çekti (dış çap: 1.5 mm) ve 10 ila 20 mm arasında değişen iç çaplarda yama ipuçları üretmek için yangın cilalanmış. Elektrot lümen banyo orta ile doludur. Amplifikatör, yukarıda belirtilen hücre içi kayıtları için kullanılan aynı. Elektrot ve sızdırmazlık direnci test akımı elektrot ile bakliyat geçerek tespit edilebilir. Mühür dirençleri M0hm 0.3 ile 1.0 arasında değişmekteydi ve elektrot direnci 0,5 ila 1,0 M.0 arasında değişmekteydi. Seal direnç kayıt boyunca izlenebilir. Quantal olaylar doğrudan sayım düşük stimülasyon frekansları ile mümkündür. Her uyarılmış yanıt için, quantal olayların sayısı tespit edilebilir. Yanıtların bir dizi için, toplam sayıları quantal olayların ardından bu direk sayımı dayalı ortalama quantal içeriğini tahmin etmek sayılır. Hesaplamak quantal içerik anlamına bir yaklaşım (del Castillo ve Katz, 1954) yanıtlarının toplam sayısı quanta ve bölme toplam sayısı alıyor. EPSPS tepe genlik veya alanı (Cooper ve ark, 1995b) de dayalı birini kullanabilirsiniz diğer yaklaşımlar vardır.