Zebra balığı Maksiller Bärbel Çalışma Yöntemleri
Summary
Zebrafish maksiller Bärbel ektodermal, mezodermal ve nöral krest türevleri içeren bir kabukla duyu organ. Önemlisi, yetişkin Bärbel proksimal amputasyon sonra yeniden oluşturabilirsiniz. Bu video maksiller Bärbel gelişimi tanıtır ve Bärbel örneklerin toplanması, gömme ve alt görüntüleme ile takip rejenerasyon ikna etmek için bir cerrahi protokolü göstermektedir.
Abstract
Barbels cilt duyusal uzantıları, balıklar, sürüngenler ve amfibiler bulundu. Zebra balığı Danio rerio barbels-kısa bir burun çifti ve uzun maksiller çiftinin iki çift geliştirir. Bärbel doku, deri hücreleri, salgı bezleri, tat tomurcukları, melanositler, dolaşım damarları ve duyusal sinirler dahil olmak üzere ektodermal, mezodermal ve nöral krest kökenli hücreler içerir. Çoğu yetişkin doku aksine, maksiller Bärbel, bize yaşam döngüsü boyunca bu doku tiplerinin geliştirme ve bakım görselleştirmek için izin, optik açıktır.
Bu video maksiller Bärbel (yaklaşık bir ay sonrası döllenme başlamadan) erken gelişim gösterir ve yenilenme yetişkin apendiks (> 3 ay sonrası fertilizasyon) ikna etmek için bir cerrahi protokol göstermektedir. Kısaca, bir anestezi balık sol maksiller karakeçi maksilla kaudal kenarı hemen distalinde steril forseps ile yükselir. Ince, steril bir yaylı makas amputasyon düzlemde anatomik için bir dönüm noktası oluşturan bu seviyede Bärbel mili kesmek için forseps karşı konumlandırılmış. Rejeneratif büyüme ve kontralateral Bärbel karşılaştırıldığında bu uçağa göre ölçülebilir. Bärbel doku yaralanma 2 hafta içinde maksimum regrowth ulaşan hızla yeniler.
Rejenere Bärbel analiz teknikleri, standart bir DNA elektroforez jel kuyulardan barbels eşli çiftler (yeniden ve kontrol) diseksiyon ve gömme içerir. Gömülü örneklerin uygun bir brüt morfolojisi ve morfometri stereomikroskop altında fotoğraflandı ve parafin histoloji gibi downstream uygulamaları öncesinde hafta boyunca saklanan cryosectioning ve / veya tüm montaj immünohistokimya olabilir. Bu yöntemler, in vivo doku sistemi, birden fazla hücre tiplerinin yenileyici kapasitesi zebrafish genetik kapsamında eğitim için bir roman olarak maksiller karakeçi kurmak .
Protocol
Discussion
Zebrafish maksiller Bärbel zebrafish çeşitli hücre tiplerinin büyüme, bakım ve yenilenme eğitim için atıl doku sistemi. Bärbel apendiks hiçbir insan analog olmasına rağmen, içerdiği hücre tipleri çok mümkün optik açık ve anatomik basit bir silindirik yapıdaki cilt bezleri, melanosit, dolaşım damarları ve sinirleri çalışmak için korunmuş bulunmaktadır. Iyi çalışılmış bir kuyruk yüzgeci, Bärbel doku amputasyon tarafından yeniden başlatılabilir. Maksilla sınır anatomik bir dönüm noktası olarak kullanarak, amputasyon düzlemde Bärbel büyütme ölçümü kolaylaştırmak, hassas şekilde yerleştirilmiş olabilir. Deneyimli bir operatör için, her ameliyat, sadece birkaç saniye sürer. Kurtarma hızlı ve balık davranışları üzerinde herhangi bir kısa ya da uzun vadeli etkileri şu ana kadar tespit ettik. Zebra balığı, bir maksiller Bärbel yüzerek cerrahi sonrası 6 aya kadar, yemek ve cerrahi olmayan kontroller olarak etkin bir şekilde doğurmak ve doku toplama süresi ile karşılaştırılabilir bir yaşam süresine sahiptir. Bu ameliyatı fizyolojik etkileri, 1) Bärbel yürütülen ekstraoral tat tomurcukları da balık epitel dudaklar, yanaklar ve yüksekliği 5 de dahil olmak üzere diğer birçok parça bulunur, çünkü çok az olacağı tahmin, ve 2) ayırt tat tomurcuklarının görünür 72 saat içinde yenileyici Bärbel (Leclair ve ark. yayınlanmamış veriler). maksiller Bärbel yara iyileşmesi, revaskülarizasyon ve reinnervation bir yetişkin omurgalı kapsamında eğitim için minimal invaziv bir sistem yapar.
Rejenerasyon cerrahi indüksiyonundan sonra, sabit doku morfometrik ölçüm ve / veya mikroskopik analiz için barbels aralıklarla toplanmalıdır. Elverişli, maksiller Bärbel cryosectioning, tüm montaj immünhistokimya ve in situ, parafin histoloji dahil olmak üzere birçok standart protokoller, uygulanmasını kolaylaştırmak için, yaklaşık uzunluğu (2-3 mm) ve bir zebrafish embriyonun çapı (100-200 mm ). melezleşme. Birlikte ele alındığında, bu özellikleri maksiller Bärbel in vivo model, doku onarımı ve yenilenmesi eğitim için son derece gerçekçi olun .
Acknowledgements
Bu yöntemler, JT, laboratuar Destek DePaul Üniversitesi Araştırma Konseyi ve JT (DE016678) NIH / NIDCR R01 hibe tarafından sağlanan bir araştırma izni sırasında EEL tarafından geliştirilmiştir. Biz minnetle Caroline Hunter, CMRC zebrafish çekirdek tesiste hayvan bakım teknisyeni lisans laboratuvar asistanı ve Paulina Pawluczuk çabaları kabul etmiş sayılırsınız.
Materials
Microscope Equipment
A stereo dissecting microscope with transmitted and incident fiber-optic illumination is required for barbel clipping and agar embedding.
Barbel Clipping
- Fish system water
- 2 zebrafish crossing tanks
- MS-222 (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate; Sigma Chemical #E10521-10G)
- sterile 120-mm Petri plate
- wet paper towels
- blunt metal spatula
- Dumont #55 Bio Inox Forceps (Fine Science Tools #11255-20)
- Mini-Vannas spring scissors (Fine Science Tools #15000-00)
- methylene blue antifungal agent (Drs. Foster & Smith #CD-905781)
- small aquarium fishnet
Tissue collection and agar embedding
- 4% paraformaldehyde in 1x phosphate-buffered saline (PF-PBS), aliquoted into 50 mL conical tubes and stored frozen at -20°C until use
- 1x phosphate-buffered saline (pH 7.27-6)
- 250 mL glass flask
- 2% agarose in distilled water
- standard small agarose gel electrophoresis rig (gel size = ~10 cm square)
- small-toothed electrophoresis sample comb (comb size 4 x 1.5 mm)
- warm water bath (50-60°C)
- laboratory tape
- black enameled insect pins, size 000 (Fine Science Tools #26000-25)
- 1-2 pin holders (Fine Science tools #26016-12)
- 9-inch glass Pasteur pipette
- pipette bulb or pump
- laboratory tissue
- small paper labels
- (optional) printed calibration scale
- wet paper towels
- zip-closure plastic bag
- scalpel/razor blade (to cut out agar blocks)
References
- Westerfield, M. Chapter 1 General Methods for Zebrafish Care. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Howe, J. C. Standard length: Not quite so standard. Fisheries Research (Amsterdam). 56, 1-7 (2002).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin Embedding Tissue Samples for Sectioning. Cold Spring Harbor Protocols. 6, (2008).
- Westerfield, M. Ch 8.3 Agar Embedding for Cryostat Sectioning of Embryos or Larvae. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Hansen, A., Reutter, K., Zeiske, E. Taste bud development in the zebrafish, Danio rerio. Dev Dyn. 223, 483-496 (2002).
