Генерация одноклеточных суспензий от мыши нервной ткани

Для работы в стерильных условиях, то рекомендуется выполнять все шаги в ламинарном боксе. 1. Материалы Нервной ткани Диссоциация Kit (P) (Компоненты: 1,2 Решение, 3 и 4, хранения буфера) Предварительное разделение Фильтры (Дополнительно) Бисер Миелин удаления Бета-меркаптоэтанол gentleMACS диссоциатор С трубы MACSmix труб Rotator HBSS (в / м) HBSS (ш) Подготовьте следующие решения до начала протокола: Буферизацией Соль Хэнкса Решение без двухвалентных катионов Са 2 + или Mg 2 + (HBSS (в / м) HBSS, стандартный, т.е. с Ca 2 + и Mg 2 + (HBSS (ш) В зависимости от антиген эпитоп заинтересованность в дальнейших приложений, использовать либо Папаин основе нервной ткани Диссоциация Kit (P) или трипсина основе нервной ткани Диссоциация Kit (T). Подготовьте следующие решения от нервной ткани Диссоциация Kit: Решение 2: добавить бета-меркаптоэтанола в 0,067 мМ Решение 4: растворить порошок в 0,7 мл буфера хранения (поставляется в комплекте), аккуратно перемешать (не вихря) Фермент Смешайте 1: Внесите 1,9 мл раствора 2 и 50 мкл раствора 1 (как из комплекта) на трубы С и выдержать в течение 10-15 минут при температуре 37 ° C. Этого достаточно, чтобы отделить 400 мг ткани головного мозга. 2. Диссоциирующего нервной ткани Взвесьте мозговой ткани в пробирку, содержащую 1 мл HBSS (в / м) Передача мозга мыши в трубку С, содержащий 1950 мкл предварительно нагретую Mix фермента 1. (ПРИМЕЧАНИЕ: этот протокол написан для ≤ 400 мг, но решение объемы могут быть расширены для размещения до 1600 мг мозговой ткани в трубы C) Место труба C на диссоциатор gentleMACS и запустить программу "m_brain_01". Инкубируйте с вращением (4 мин использованием Rotator MACSmix Tube) в течение 15 мин при 37 ° C. Место труба C на диссоциатор gentleMACS и запустить программу "m_brain_02". На этапе подготовки диссоциации 30 мкл ферментного Mix 2 на 400 мг ткани, аккуратно смешивания 20 мкл раствора 3 и 10 мкл раствора 4. Добавить ферментов Mix 2 до станции метро С помощью перегородки уплотнением крышки и аккуратно перемешать без вортексе. Инкубируйте труба C с вращением в течение 10 мин при 37 ° C в инкубаторе. Место труба C на диссоциатор gentleMACS и запустить программу "m_brain_03". Инкубируйте труба C с вращением в течение 10 мин при 37 ° C в инкубаторе. Центрифуга кратко собрать образцы в нижней части трубы. 3. Фильтрация Выбор фильтра достаточно большой, чтобы позволить переход к клеткам интерес. Например, клетки Пуркинье являются слишком большими, чтобы пройти через 30 мкм фильтр, но Prominin-1 + клетки. Используйте suitable1000 мкл пипетки, чтобы удалить клетки образуют трубки С через перегородку уплотнением крышки и применить его к Предварительное разделение Фильтр по 15 мл пробирки. (ПРИМЕЧАНИЕ: для увеличения размеров выборки использовать 50 мл пробирки). Промойте фильтр 10 мл HBSS (W). Центрифуга отфильтрованных ячеек при 300 мкг в течение 10 мин при комнатной температуре. Ресуспендируют supernatent в вашей среде или буфера выбора для последующего применения. Для удаления миелина мусора, использовать бисер Миелин удаления. 4. Представитель Результат: Пожалуйста См. рисунки 1-3 Рис. 1 мозг диссоциации с диссоциатор gentleMACS привело к 97% жизнеспособных клеток, а проточной цитометрии показывает анализ. Рис. 2 Легкий картина микроскопа neurosphere образование после магнитной сортировки клеток с использованием Anti-Prominin-1 микрошарики через 7 дней культивирования в MACS ® NeuroMedium дополнен MACS Дополнение B27 PLUS. Клетки были получены из CD1 мозга мыши (P3) с помощью нервной ткани Диссоциация Kit (Р). Рис. 3 Миелин мусор в одно-клеточные суспензии значительно ухудшает изолятор, и удаление миелина мусора бисером Миелин удаление увеличивает эффективность разделения клетки. Для MACS Цветоделение использованием Anti-Prominin-1 микрошарики, P22 мозга мыши был диссоциированных использованием нервной ткани Диссоциация Kit (Р). Клетки из одной клеточной суспензии были либо непосредственно используется для разделения, или были представлены миелина истощения использованием бисера Миелин удаления. Сравнение отделение от образцов без и с удалением миелина, показывает, что чистота выше для образцов с предыдущим удаление миелина.