Sigma non specifiche attività di analisi della proteasi - caseina come substrato

Prima di iniziare il test, dobbiamo fare in modo che i seguenti reagenti sono correttamente preparati: A 50 mM tampone fosfato di potassio, pH 7,5. Preparare con 11,4 mg / ml di fosfato di potassio bibasico, triidrato in acqua purificata e la regolazione del pH con HCl 1M. Questa soluzione è posizionato a 37 ° C prima dell'uso. Un 0,65% peso / volume soluzione di caseina, preparato miscelando 6,5 mg / ml di caseina nel buffer 50 mM fosfato di potassio. Gradualmente aumentato la temperatura della soluzione con delicata agitazione a 80-85 ° C per circa 10 minuti fino a una dispersione omogenea è raggiunto. E 'molto importante non far bollire la soluzione. Il pH è quindi regolata, se necessario, con NaOH e HCl. A 110 mM soluzione di acido tricloroacetico, preparata diluendo un magazzino 1:55 6.1N con acqua purificata. L'acido tricloroacetico è un acido forte e deve essere maneggiato con cura. 0.5 mM Folin & Ciolcaltea, o reagente fenolo Folin, che è la soluzione che reagisce con tirosina per generare un cambiamento misurabile colore che saranno direttamente collegati con l'attività delle proteasi. Reagente Folin fenolo è un acido e deve essere maneggiato con cura. A mm 500 carbonato di sodio soluzione, preparata con 53 mg / ml di carbonato di sodio anyhydrous in acqua purificata. Una soluzione diluente enzima, che è composto da 10 mM tampone di acetato di sodio con calcio acetato 5mm, pH 7,5, a 37 ° C. Questa soluzione è quello che usiamo per sciogliere i campioni della proteasi solidi o soluzioni diluite enzima. 1,1 mm L-tirosina soluzione madre standard. Preparati con 0,2 mg / ml L-tirosina in acqua depurata e riscaldata dolcemente fino alla tirosina si dissolve. Come con la caseina, non bollire questa soluzione. Lasciare che la L-tirosina standard per raffreddare a temperatura ambiente. Questa soluzione sarà diluita ulteriormente per rendere la nostra curva standard. Proteasi soluzione. Immediatamente prima dell'uso, sciogliere proteasi in soluzione diluente enzimatica preparata al punto 6. Se necessario, utilizzare un campione solido proteasi di attività predeterminate, che viene disciolto utilizzando un diluente enzima di 0,1-0,2 unità / ml. Questa soluzione serve come controllo positivo per il test di controllo qualità e la convalida per i calcoli che si esibiranno per determinare l'attività enzimatica. Impostazione del saggio della proteasi e Curve standard Per iniziare questo saggio, trovano fiale adatto che conterrà circa 15 ml. Per ogni enzima che sarà testato, 4 flaconcini sono necessari. Un flaconcino sarà usato come un vuoto, e tre altri saranno utilizzati per attività di analisi di tre diluizioni della proteasi. Tre diluizioni sono utili per la verifica dei calcoli finale contro l'altro. Per ogni serie di quattro fiale, aggiungere 5mls della nostra soluzione di caseina 0,65%. Lasciate che equilibrano in un bagno d'acqua a 37 ° C per circa 5 minuti. Aggiungi variando volumi di soluzione enzimatica che sarà testato per tre fiale campione del test, ma non il vuoto. Mescolare agitando e incubare per 37 ° C per dieci minuti esatti. L'attività della proteasi e liberazione consequenziali di tirosina durante questo periodo di incubazione è quello che sarà misurato e confrontato tra i campioni di prova. Dopo questa incubazione di 10 minuti, aggiungere i 5 ml di reagente TCA a ciascuna provetta per arrestare la reazione. Quindi, aggiungere un volume adeguato di soluzione enzimatica a ciascuna provetta, anche il vuoto, in modo che il volume finale della soluzione enzimatica in ogni tubo è di 1 ml. Questo viene fatto per conto del valore di assorbanza dello stesso enzima e per garantire che il volume finale di ogni tubo è uguale. Incubare le soluzioni a 37 ° C per 30 minuti. Durante questa incubazione di 30 minuti, si consiglia di impostare il diluizioni tirosina standard. Usa 6 flaconi dram (fiale DRAM possono essere sostituiti con tubi in polipropilene) che può facilmente contenere 8 ml. Per i sei fiale, aggiungere il 1,1 mm soluzioni tirosina magazzino di serie con i seguenti volumi in ml: 0,05, 0,10, 0,20, 0,40, 0,50. Non aggiungere alcun tipo di tirosina al vuoto. Abbassare gli standard possono essere necessari per campioni impuri che darà piccolo cambiamento di colore. Una volta che la soluzione di tirosina standard è stato aggiunto, aggiungere un volume adeguato di acqua depurata a ciascuno degli standard per portare il volume a 2 ml. Dopo l'incubazione di 30 minuti, filtrare ciascuna delle soluzioni di test e il vuoto usando una siringa da 0,45 um polietersulfone filtro. La filtrazione è necessario per rimuovere eventuale insoluto dai campioni. Aggiungere la filtrazione 2 mls dei campioni di prova e nel bianco filtrato a 4 flaconcini DRAM che può contenere almeno 8 ml. Lo stesso tipo di fiala in cui sono stati preparati gli standard può essere utilizzato. Per tutti i flaconi contenenti gli standard e vuoto standard, aggiungere 5mls di carbonato di sodio. Per ottenere i migliori risultati, aggiungere 1 ml di reattivo di Folin immediatamente dopo. Aggiungi carbonato di sodio per regolare ogni goccia di pH creato con l'aggiunta di reagente di Folin ha. Aggiungi carbonato di sodio per i campioni di prova e test vuoto. Queste soluzioni diventa opaco dopo l'aggiunta di carbonato di sodio. Aggiungere il reagente di Folin, che reagiscono soprattutto con tirosina libero. Mescolare le fiale dram agitando e incubare a 37 ° C per 30 minuti. Dopo questa incubazione, si dovrebbe notare che le norme hanno una gradazione di colore correlazione con la quantità di tirosina aggiunta: la più alta concentrazione di tirosina che appaiono più scure. Si può notare anche modificare sensibilmente il colore nei nostri campioni di prova. 2mls di queste soluzioni sono filtrate con un 0,45 polietersulfone siringa filtro in cuvette adatto. Ora che il test viene eseguito, si può procedere allo spettrofotometro per registrare i nostri valori di assorbanza. Misurare l'assorbanza e calcolo attività enzimatica L'assorbanza dei campioni si misura con uno spettrofotometro utilizzando una lunghezza d'onda di 660 nm. Il percorso della luce è impostato su 1 cm. Registrare i valori di estinzione di tali norme, vuoto standard, i campioni di prova diversi, e prova in bianco. Una volta che tutti i dati sono stati raccolti, la curva standard può essere creato. Al fine di generare la curva, la differenza di assorbanza tra il bianco standard e standard devono essere calcolati. Questo è il valore di assorbanza attribuibile alla quantità di tirosina nelle soluzioni standard. Dopo questo semplice calcolo, creare la curva standard utilizzando un programma grafico per tracciare la variazione di assorbanza dei nostri standard sull'asse Y, contro l'importo in micromoli per ciascuno dei nostri 5 standard sull'asse X. Volume standard di tirosina uMoles Tirosina 0,05 0,055 0,10 0,111 0,20 0,221 0,40 0,442 0,50 0,553 Dopo i punti dati sono stati inseriti, generare una retta di regressione e l'equazione pendenza corrispondente. Trovare la variazione di assorbanza nei campioni analizzati calcolando la differenza tra l'assorbanza campione da analizzare e l'assorbanza del bianco prova. Inserimento del valore di assorbanza per uno dei campioni di prova nell'equazione pendenza e risolvere comporterà la micromoli di tirosina liberato durante questa reazione proteolitica particolare. Per ottenere l'attività dell'enzima in unità per / ml, eseguire il seguente calcolo: (Equivalenti tirosina umole rilasciato) x (11) Unità / ml = enzima __________________________________________ (1) x (10) x (2) 11 = il volume totale (in millilitri) di test 10 = Tempo di test (in minuti) secondo la definizione di unità 1 = Volume di enzimi (in millilitri) di enzima usato 2 = volume (in millilitri) utilizzati nella determinazione colorimetrica Prenda il numero di equivalenti micromoli tirosina rilasciato ottenuto dall'equazione pendenza e moltiplicarlo per il volume totale del test in MLS, che nel nostro caso è 11mls. Dividere questo valore per tre quantità di altri: il tempo del test, che abbiamo corso per 10 minuti, il volume di enzima utilizzato nel test, che è stato variato (usiamo 1ml), il volume di millilitri utilizzati nel rilevamento colorimetrico, che può differiscono in base alla cuvetta. Abbiamo usato 2 ml. Micromoli di tirosina divise da tempo nella misurazione minuto i rendimenti di attività della proteasi chiamata "unità". Siamo in grado di annullare le unità di misura del volume nel numeratore e denominatore, lasciando un measurment di attività enzimatica in termini di unità / ml. Al fine di determinare l'attività in un campione della proteasi solida diluito in diluente enzima, dividiamo la nostra attività in unità / ml per la concentrazione di solidi utilizzati in questo saggio originariamente in mg / ml., Lasciandoci con l'attività in termini di unità / mg . Unità / ml di enzima Unità / mg solido = _____________________ mg solidi / ml di enzima