Sigma的非特异性蛋白酶活性测定 - 酪蛋白作为基质

在开始检测之前，我们需要确保正确地准备以下试剂： 50毫米的磷酸钾缓冲液，pH值7.5。准备用11.4毫克/毫升，钾phospate二元，纯净水，用1M盐酸调节pH值的三水。这个解决方案是在37 ° C，使用前放置。 一个0.65％重量/体积的酪蛋白溶液，混合，在50 mM磷酸钾缓冲6.5毫克/毫升酪蛋白准备。逐渐升高溶液温度80-85℃，约10分钟轻轻搅拌，直到均匀的分散实现。这是非常重要的是不要熬的解决方案。必要时用NaOH和HCl调整pH值。 一个110毫米的三氯乙酸溶液，用纯净水稀释一个6.1N股票1:55准备。三氯乙酸是一种强酸，应小心处理。 0.5毫米福林Ciolcaltea的，或福林酚试剂，这是解决方案，将与酪氨酸反应，生成一个可衡量的的颜色变化，将直接关系到蛋白酶的活性。福林酚试剂是一种酸，应谨慎处理。 500毫米碳酸钠的解决方案，准备使用纯净水53毫克/毫升的anyhydrous碳酸钠。 一种酶稀释剂的解决方案，其中包括10 mM磷酸钠，醋酸钙5MM醋酸缓冲液，pH值7.5，在37 ° C。这个解决方案是我们用来溶解固体蛋白酶样品或稀释酶解决方案。 1.1毫米L -酪氨酸的标准储备溶液。准备使用0.2 mg / ml的L -酪氨酸，在纯净水和加热，轻轻酪氨酸溶解。与酪蛋白，这种解决方案不开锅。 L -酪氨酸的标准冷却到室温。该解决方案将进一步被摊薄，使我们的标准曲线。 蛋白酶的解决方案。使用前，溶解蛋白酶的酶稀释液在第6步准备的解决方案。 如果有必要，使用了预定的活动奠定坚实的蛋白酶样品，这是用酶稀释液0.1-0.2单位/ ml溶解。该解决方案作为一个质量控制检测的阳性对照和验证的计算，我们将执行确定酶的活性。 设立蛋白酶含​​量及标准曲线要开始这个实验中，找到合适的，将举行约15毫升的小瓶。对于每个将被测试的酶，需要4瓶。一小瓶将被用来作为一个空白，和其他三人将被用来检测三个稀释的蛋白酶活性。三稀释检查时，对对方的最终计算是有用的。 每一套四瓶，添加0.65％酪蛋白溶液5mls。让他们在37℃水浴平衡5分钟左右彗星。 添加不同的酶液，将被测试的测试样品瓶三个卷，但不是空白。混合纷飞和37 ° C孵育整整10分钟。蛋白酶活性和酪氨酸相应的解放，在这个孵化时间是将被测量和比较试验样品。 这10分钟的潜伏期后，每管加入5毫升的TCA试剂终止反应。然后，添加适当的酶液量，以每管，甚至空白，使酶液，每管最终成交量是1毫升。这样做是考虑到酶本身的吸光度值，以确保在每管的最后体积等于。的解决方案在37 ° C下30分钟。 在这30分钟的孵育，您可能需要设置您的酪氨酸标准稀释。使用6 DRAM小瓶（DRAM小瓶，可取代聚丙烯管），可以轻松容纳8 MLS。到六瓶，加入MLS以下几卷的1.1毫米酪氨酸的标准储备溶液：0.05，0.10，0.20，0.40，0.50。不添加任何酪氨酸标准的空白。不纯的测试样本，将产生的颜色变化不大，可能需要降低标准。一旦酪氨酸标准溶液已被添加，添加适当体积的纯净水标准，把2毫升的量。 经过30分钟的孵化，筛选每个测试解决方案，并使用0.45微米的聚醚砜注射器过滤器的空白。过滤器是必需的，从样本中删除任何不溶物。 过滤测试样品2毫升和空白滤液4 DRAM小瓶，可容纳至少8 MLS。可以使用同一类型的小瓶，其中的标准准备。 所有的小瓶含有的标准和标准的空白，添加碳酸钠5mls。为了达到最佳效果，随即添加1毫升福林的试剂。 添加碳酸钠规范福林试剂除了创建任何pH值下降。 添加碳酸钠，测试样品和工商业污水附加费t空白。这些解决方案成为后的碳酸钠除了阴天。新增的福林试剂，将主要免费酪氨酸反应。 混合纷飞的DRAM小瓶，并在37 ° C孵育30分钟。 此潜伏期后，你应该注意到，标准的色阶与酪氨酸添加量相关的;酪氨酸的最高浓度出现的最黑暗的。您也可以通知我们的测试样本中明显的颜色变化。这些解决方案2mls到合适的试管中使用0.45微米的聚醚砜注射器过滤器过滤。现在进行检测，你可以继续分光光度计记录我们的吸光度值。 测吸光度，计算酶的活性一个使用660nm波长的分光光度计测量样品的吸光度。光路设置为1cm。记录的标准，标准的空白，不同的测试样本，和测试空白的吸光度值。一旦所有的数据都已经收集，可以创建标准曲线。为了生成的曲线，在吸光度之间的​​标准和标准的空白差异，必须计算。这是吸光度值占酪氨酸量标准的解决方案。这个简单的计算后，建立标准曲线，使用图形程序绘制Y轴的改变，在我们的标准的吸光度，对我们的5 X轴的标准量在微摩尔。 酪氨酸标准卷 uMoles酪氨酸 0.05 0.055 0.10 0.111 0.20 0.221 0.40 0.442 0.50 0.553 已输入的数据点后，生成一个最适合和相应的缓坡方程的行。 查找计算测试样品的吸光度和测试空白的吸光度之间的​​差异的测试样品的光吸收变化。插入缓坡方程的一个测试样品的吸光度值和解决，将导致酪氨酸解放微摩尔在这个特殊的蛋白水解反应。为了得到每单位/毫升的活性酶，执行下列计算： （发布umole酪氨酸等效）×（11） 单位/毫升酶= _________________________________________ （1）X（10）×（2） 11 =总体积（毫升）的测定 10 =时间法（分钟）为单位定义 1 =酶的酶量（毫升）使用 2 =体积（毫升）比色法测定 以微摩尔酪氨酸从缓坡方程获得等值发布的数量和乘以MLS的检测，这在我们的例子是11mls总量。的酶量的检测中使用，分成三个其他数量这个值：的检测，其中我们10分钟跑的时候，是不同的（的使用1毫升），的比色法检测毫升的量，这可能你的比色皿不同的基础上。我们用2毫升。 按时间分为酪氨酸微摩尔分钟产量蛋白酶活性的所谓“单位”的测量。我们可以取消了单位体积中的分子和分母的测量，留在单位/ ml酶的活性measurment。为了确定了坚实的蛋白酶的酶稀释液稀释后的样品的活性，分裂我们的活动，在单位/毫升浓度毫克/毫升。原本在这个实验中使用的固体，留给我们单位/ mg活动。 单位/毫升酶单位/ mg固体= ____________________ 固体毫克/毫升酶