Sigma non spécifiques Assay activité de la protéase - caséine comme substrat

Avant de commencer l'essai, nous avons besoin pour s'assurer que les réactifs suivants sont correctement préparées: Un tampon phosphate de potassium 50 mM, pH 7,5. Préparer en utilisant 11,4 mg / ml de phosphate de potassium dibasique, trihydraté dans l'eau purifiée et d'ajuster le pH avec HCl 1M. Cette solution est placée à 37 ° C avant utilisation. Une solution de caséine à 0,65% en poids / volume, préparé en mélangeant 6,5 mg / ml de caséine dans le tampon phosphate de potassium 50 mM. Progressivement augmenté la température de la solution en agitant doucement à 80-85 ° C pendant environ 10 minutes jusqu'à obtenir une dispersion homogène est atteint. Il est très important de ne pas faire bouillir la solution. Le pH est ensuite ajusté, si nécessaire avec NaOH et HCl. Une solution 110 mM d'acide trichloracétique, préparé en diluant un stock de 01h55 6.1N avec de l'eau purifiée. L'acide trichloracétique est un acide fort et doit être manipulé avec soin. 0,5 mM Folin & Ciolcaltea, ou réactif de phénol de Folin, qui est la solution qui va réagir avec la tyrosine à générer un changement de couleur mesurables qui seront directement liés à l'activité des protéases. Réactif de Folin phénol est un acide et doit être manipulé avec soin. Une solution 500 mM Sodium Carbonate, préparés en utilisant 53 mg / ml de carbonate de sodium dans l'eau purifiée anyhydrous. Une solution de diluant enzyme, qui se compose de 10 mM de tampon acétate de sodium avec de l'acétate de calcium 5mM, pH 7,5, à 37 ° C. Cette solution est ce que nous utilisons pour dissoudre les échantillons solides ou protéase solutions diluées enzyme. 1,1 mM de L-tyrosine solution stock standard. Préparé en utilisant 0,2 mg / ml de L-tyrosine dans l'eau purifiée et chauffée doucement jusqu'à ce que la tyrosine se dissout. Comme avec la caséine, ne pas faire bouillir cette solution. Autoriser la norme de L-tyrosine refroidir à température ambiante. Cette solution sera diluée davantage pour faire de notre courbe standard. Solution de protéase. Immédiatement avant utilisation, dissoudre dans une solution de protéase diluant d'enzyme préparée à l'étape 6. Si nécessaire, utilisez un échantillon de protéase solide de l'activité prédéterminé, qui est dissous en utilisant le diluant d'enzymes à 0,1-0,2 unités / ml. Cette solution sert de contrôle positif pour le test de contrôle qualité et la validation des calculs nous allons effectuer pour déterminer l'activité enzymatique. Mise en place du dosage de la protéase et des courbes standard Pour commencer ce test, trouver des flacons adaptés qui contiendra environ 15 ml. Pour chaque enzyme qui seront testés, 4 flacons sont nécessaires. Un flacon sera utilisé comme un blanc, et trois autres seront utilisés pour l'activité de dosage de trois dilutions de la protéase. Trois dilutions sont utiles lors de la vérification des calculs finale contre l'autre. Pour chaque série de quatre flacons, ajoutez 5 ml de notre solution de caséine à 0,65%. Qu'ils s'équilibrer dans un bain d'eau à 37 ° C pendant environ 5 minutes. Ajouter des volumes variables de solution enzymatique qui sera testé à trois des fioles d'échantillon de test, mais pas le vide. Mélanger en remuant et laisser incuber à 37 ° C pendant exactement dix minutes. L'activité de la protéase et la libération de la tyrosine consécutifs pendant ce temps d'incubation est de ce qui sera mesuré et comparé entre les échantillons de test. Après cette incubation de 10 minutes, ajouter les 5 ml du réactif TCA dans chaque tube pour arrêter la réaction. Ensuite, ajoutez un volume approprié de solution d'enzyme dans chaque tube, même le blanc, de sorte que le volume final de solution d'enzyme dans chaque tube est de 1 ml. Ceci est fait pour rendre compte de la valeur d'absorption de l'enzyme elle-même et pour s'assurer que le volume final de chaque tube est égal. Incuber les solutions à 37 ° C pendant 30 minutes. Pendant cette incubation de 30 minutes, vous pouvez configurer votre tyrosine dilutions standard. Utilisez 6 flacons DRAM (DRAM flacons peuvent être remplacés par des tubes en polypropylène) qui peut facilement contenir 8 ml. Pour les six fioles, ajouter les 1,1 mM tyrosine solutions de stock standard avec les volumes suivants de la MLS: 0,05, 0,10, 0,20, 0,40, 0,50. Ne pas ajouter de toute norme de tyrosine à la vierge. Normes inférieures peuvent être nécessaires pour des échantillons de test impurs qui donneront changement de couleur peu. Une fois la solution de tyrosine standard a été ajouté, ajouter un volume approprié d'eau purifiée pour chacune des normes pour porter le volume à 2 ml. Après l'incubation de 30 minutes, le filtre de chacune des solutions de test et le blanc en utilisant une seringue de 0,45 um polyéthersulfone filtre. La filtration est nécessaire pour éliminer toute insolubles à partir des échantillons. Ajouter la filtration 2 ml des échantillons de test et vierge filtrat à 4 flacons de DRAM qui peut contenir au moins 8 ml. Le même type de flacon dans lequel les normes ont été préparées peuvent être utilisées. Pour tous les flacons contenant les normes et standards vierge, ajoutez 5 ml de carbonate de sodium. Pour de meilleurs résultats, ajouter 1 ml de réactif de Folin a tout de suite après. Ajouter du carbonate de sodium à réglementer toute baisse de pH créé par l'ajout du réactif de Folin l'a. Ajouter carbonate de sodium pour les échantillons à tester et TESvierge t. Ces solutions deviennent troubles après l'ajout de carbonate de sodium. Ajouter le réactif de Folin l', qui va réagir principalement avec la tyrosine libre. Mélangez les flacons dram par tourbillonnement et incuber à 37 ° C pendant 30 minutes. Après cette incubation, vous devriez remarquer que les normes ont une gradation de couleur en corrélation avec la quantité de tyrosine ajoutée; concentrations les plus élevées de la tyrosine sombres apparaissent. Vous pouvez également changer la couleur préavis appréciable dans nos échantillons de test. 2mls de ces solutions sont filtrées à l'aide de 0,45 um polyéthersulfone filtre seringue dans des cuvettes appropriés. Maintenant que le dosage est effectué, vous pouvez procéder au spectrophotomètre pour enregistrer nos valeurs d'absorbance. De mesurer l'absorbance et de calculer l'activité enzymatique L'absorbance des échantillons est mesurée par un spectrophotomètre en utilisant une longueur d'onde de 660nm. Le trajet de la lumière est réglée à 1cm. Enregistrer les valeurs d'absorbance pour les normes, les standards vierge, les échantillons d'essai différentes, et vierge de test. Une fois toutes les données ont été recueillies, la courbe standard peut être créé. Afin de générer la courbe, la différence d'absorbance entre le blanc standard et standard doit être calculé. Il s'agit de la valeur d'absorbance due à la quantité de tyrosine dans les solutions standard. Après ce calcul simple, créer la courbe standard à l'aide d'un programme graphique pour tracer le changement d'absorbance de nos normes sur l'axe Y, par rapport au montant en micromoles pour chacun de nos cinq normes sur l'axe X. Volume de la norme Tyrosine Tyrosine umoles 0,05 0,055 0,10 0,111 0,20 0,221 0,40 0,442 0,50 0,553 Après les points de données ont été entrées, générer une ligne de meilleur ajustement et l'équation de pente correspondant. Trouver le changement d'absorbance dans les échantillons de test en calculant la différence entre l'absorbance de l'échantillon de test et l'absorbance du blanc d'essai. Insertion de la valeur d'absorbance de l'un des échantillons d'essai dans l'équation de pente et la résolution de se traduira par la micromoles de tyrosine libérée au cours de cette réaction protéolytique particulière. Pour obtenir de l'activité de l'enzyme en unités par / ml, effectuer le calcul suivant: (Umole équivalents tyrosine libérée) x (11) Unités / ml = Enzyme __________________________________________ (1) x (10) x (2) 11 = volume total (en millilitres) de dosage 10 = Temps d'essai (en minutes) selon la définition Unité 1 = Volume d'enzyme (en millilitres) d'enzyme utilisée 2 = Volume (en millilitres) utilisées dans la détermination colorimétrique Prenez le nombre d'équivalents micromoles tyrosine libérée obtenus à partir de l'équation de pente et le multiplier par le volume total de l'essai dans la MLS, qui dans notre cas est 11mls. Diviser cette valeur par trois autres quantités: le temps de l'essai, ce qui nous avons couru pendant 10 minutes, le volume d'enzyme utilisé dans le dosage, qui était variée (nous allons utiliser 1ml), le volume de millilitres utilisés dans la détection colorimétrique, ce qui peut diffèrent en fonction de votre cuvette. Nous avons utilisé 2 ml. Micromoles de la tyrosine, divisé par le temps en minutes rendements mesure de l'activité de la protéase appelée «unités». Nous pouvons annuler les unités de mesure de volume dans le numérateur et le dénominateur, laissant un measurment de l'activité enzymatique en termes d'unités / ml. Afin de déterminer l'activité dans un échantillon de protéase solides diluées dans du diluant d'enzymes, nous divisons notre activité en unités / ml par la concentration de solides utilisés dans cet essai à l'origine en mg / ml., Nous laissant avec l'activité en termes d'unités / mg . Unités / ml enzyme Unités / mg de solide = _____________________ mg de solide / enzyme ml