Screening op Amyloid Aggregation door semi-denaturerende Detergent-agarosegelelektroforese

Deel 1: Voorbereiden van de gel Monteer de gel gieten lade. Standaard uitrusting voor horizontale DNA elektroforese kunnen worden gebruikt. Voor grote aantallen monsters, bereiden we een 20 cm x 24 cm plaat met maximaal vier 50-well kammen. Zorg ervoor dat de plaat geen krassen heeft, want deze kunnen de blot afbeelding te vervormen. Maak een 1,5% agarose-oplossing (medium of hoge gel-sterkte, laag EMO) in 1X TAE. Het volume moet voldoende zijn om volledig onder water de kam tanden – wil je zo veel monster belasting mogelijk om detectie te maximaliseren. Magnetron van het mengsel tot de agarose volledig is opgelost. Snel toevoegen SDS tot 0,1% ten opzichte van een 10% voorraad. Swirl te mengen. Als sommige agarose stolt tijdens deze stap, weer wordt opgelost met behulp van een kookplaat en wees voorzichtig om te voorkomen dat koken. Giet de oplossing in de casting lade. Gebruik een kam te harken uit eventuele luchtbellen, als ze maar konden later interfereren met transfer. Na de gel heeft, te verwijderen kammen en plaats de gel in de gel tank. Volledig onderdompelen van de gel in 1X TAE met 0,1% SDS. Deel 2: Voorbereiding van monsters Voor de high-throughput analyse van gist lysaten, beginnen we met 2-ml culturen gedurende de nacht gekweekt met snelle agitatie in 96-well blokken. In dit geval, elke cultuur is overexpressie een eiwit van belang. Bij het analyseren van lage abundantie eiwitten, moet grotere cultuur volumes worden gebruikt Oogst cellen door centrifugeren bij 2000 RCF gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Weer Resuspendeer cellen in water en centrifuge. Resuspendeer in 1 ml spheroplasting oplossing. Incubeer gedurende ongeveer 30 minuten bij 30 ° C (u kunt spheroplasting efficiency bevestigen met microscopie). Centrifugeer bij 800 RCF gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Volledig te verwijderen supernatant. Resuspendeer gepelleteerd spheroplasts in 100 ml lysis buffer. Bedek het blok met tape en vortex op hoge snelheid gedurende 2 minuten. Pellet cellulaire puin bij 4000 RCF gedurende 2 minuten. Voorzichtig supernatant te verwijderen om een ​​nieuwe container, bijvoorbeeld, een 96-well PCR-plaat. Indien gewenst, bepalen de eiwitconcentratie van de lysaten. Voeg 4X sample buffer om de monsters te lysaten met 1X sample buffer te genereren. Incubeer 5 minuten bij kamertemperatuur. Lading gel. Indien gewenst, op te slaan helft van de steekproef volume en kook het voor SDS-PAGE analyse. Om de mate van overdracht te controleren later, onder andere een pre-gekleurde SDS-PAGE marker. Bovendien kan een moleculair gewicht marker die bestaat uit een zeer grote eiwitten (bijvoorbeeld kip pectoralis extract) worden gebruikt om de grootte van de complexen opgelost te schatten. Op een laag voltage (≤ 3 V / cm gel lengte) tot de kleurstof voorkant bereikt ~ 1 cm van het einde van de gel. Dit zal enkele uren duren. Het is belangrijk dat de gel koud blijven, omdat anders de verspreiding van een laag moleculair gewicht eiwit (bijv. monomeren) kunnen beperken hun detectie. Deel 3: Overdracht Knip een stuk van nitrocellulose met dezelfde afmetingen als de gel. Knip 20 stukjes van GB004 en 8 stukjes GB002 vloeipapier, met dezelfde afmetingen als de gel. Snij een extra stukje GB004 om te worden gebruikt als een lont, maken ongeveer 20 centimeter breder dan de gel. Dompel de nitrocellulose, lont, en 4 stuks van de GB002 in 1X TBS. In een plastic container, assembleren een stapel papieren als volgt: 20 stuks van droge GB004, dan 4 stuks van droge GB002, dan is een stuk van de pre-wet GB002. Leg de nitrocellulose op de top van deze stapel. Spoel de gel op de casting bak kort in om het overtollige water loopt buffer te verwijderen. Dan, voorzichtig beginnen met de gel glijden de lade op de stack. Terwijl schuiven de gel uit de lade, blussen het membraan met TBS als nodig is. De extra buffer helpt te voorkomen dat bellen van vast komen te zitten onder de gel. Een overdracht pipet werkt goed voor dit doel. Nadat de gel is verplaatst naar de stapel, grondig te controleren op luchtbellen. Als er aanwezig zijn, til de rand van de gel en opnieuw buffer totdat de bellen kunnen worden uitgewerkt. Doe de overige drie pre-bevochtigd GB002 stukjes op de top van de gel. Zorg voor een goed contact tussen alle lagen door het werpen van een pipet stevig aan de bovenkant van de stapel. Flank de overdracht stapel met twee verhoogde bakken met TBS. Drapeer de pre-nat wiek over de hele stack zodanig dat beide uiteinden van de pit wordt ondergedompeld in TBS. Dek de verzamelde overdracht schoorsteen met een extra plastic bak met extra gewicht (bijvoorbeeld een 500 ml fles water). Laat de overdracht aan te gaan voor een minimum van drie uur of 's nachts. Na de overdracht, kan het membraan worden verwerkt door standaard Western blotting. Spheroplasting Solution 1,2 M D-sorbitol 0.5 mM MgCl 2 20 mM Tris, pH 7,5 50 mM BME (add vers) 0,5 mg / ml Zymolyase 100T (add vers) coration: onderstrepen; "> Lysis Buffer 100 mM Tris 7.5 50 mM NaCl 10 mM BME (add vers) proteaseremmers (toe te voegen vers) 4X Sample Buffer 2X TAE 20% glycerol 8% SDS broomfenolblauw de voorkeur