Inmunoprecipitación de la cromatina de células estaminales embrionarias humanas

Descongelación células madre embrionarias (que no aparecen en el vídeo) Las células ES son congelados en un medio que contiene 10% de DMSO. Desde el DMSO puede inducir la diferenciación de células madre embrionarias, que puede ser posible para descongelar las células al final del día y lo que para cambiar el medio a la mañana siguiente para minimizar los efectos de DMSO residual. Un abrigo de 6 pocillos placa de cultivo de tejidos con el 0,1% de gelatina durante al menos 15 minutos y aspire inmediatamente antes de que células de la placa en. Descongelar las células ES (aproximadamente 5 × 10 6 células, lo que equivale a una confluencia de 6 pocillos) en un baño de agua 37 ° C y se diluye en 10 ml de medio precalentado de células ES. Que sedimenten las células al girar durante 10 minutos a 1000 rpm en una centrífuga clínica de sobremesa. Aspirar de medio y las células suavemente volver a suspender en 10 ml de 37 º C a medio precalentado. Transferencia de suspensión de células a la placa de 6 pocillos y crecer a 37 ° C en un 5% humidificado incubadora de CO 2. Cambio de medio al día siguiente para eliminar las células muertas y DMSO residual. Pasaje y la expansión de cultivos de células ES Las células ES son rutinariamente pases es de 2 / 3 días, y el medio se cambia en días alternos. Así, las células ES requieren atención diaria. En nuestra experiencia, de alimentación independiente de células madre embrionarias crecen rápidamente y pronto se acidifica el medio, dándole vuelta amarillo. Permitiendo a las células para acidificar el medio (por no cambiar los medios de comunicación todos los días o por pases de las células en demasiado bajo una dilución) hará que las células se someten a la crisis, lo que provocó el exceso de diferenciación y muerte celular, tras lo cual su totipotencia no se puede garantizar. Las células de placas en muy baja densidad, dispersión insuficiente de las células durante el paso, o placas irregulares pueden causar problemas similares, como las células se forman grandes grupos antes de llegar a la confluencia y las células dentro de estos grupos se diferencian o mueren. La línea germinal de transmisión es una reducción significativa en las células que han sido maltratados, incluso cuando parecen sanos al momento de la inyección. Por una confluencia de 6 pocillos de células aspirar a medio y lavar con 2.3 ml de 37 ° C PBS precalentado, pipeteado lejos de las células. Cubrir las células con 1 ml de 1 × solución de tripsina durante 3-4 minutos o hasta que las células están repartidos en pequeños grupos. Añadir 1 ml de medio de inactivar la tripsina. Recoger las células con tripsina y células de la placa (generalmente 2 / 5 de bien) a un recién gelatinizado de 6 pocillos. Congelar células ES Trypsinize una confluencia de 6 pocillos (aproximadamente 1 × 10 7 células) como se describió anteriormente. Recoger las células con tripsina en 9 ml de medio y pellets durante 5 minutos a 1.000 rpm. Aspirar de mediano y resuspender el sedimento celular en 1 ml de medio de congelación recién preparada. Alícuota de 0,5 ml de células en dos criotubos. Congelar los viales a -80 ° C durante la noche y traslado al nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo. Chip-on-chip PROCEDIMIENTO Inmunoprecipitación Las células de formaldehído entrecruzamiento (para células en suspensión) Use 5 x 10 7 – 1 x 10 8 células por inmunoprecipitación. Añadir formaldehído fresco a la suspensión celular a una concentración de 1%. Incuba células con una solución de formaldehído durante 10 minutos a temperatura ambiente. Añadir un volumen 1 / 10 de 1,25 M de glicina para calmar el formaldehído. Enjuague las células dos veces con 10 ml de PBS 1x. Las células de la piscina en 50 ml tubos cónicos y giran a 700 g por 5 min a 4 ° C. Descartar el sobrenadante y el pellet se resuspende en 1,5 ml de tampón de lisis. La transferencia de células en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Flash-congelación de tres veces las células en nitrógeno líquido y el uso de un triturador de tejidos para romper las células. Una vez que las células se entrecruzan, se pueden conservar congelados a -80 ° C por tiempo indefinido. La preparación de partículas magnéticas (Pasos son todas realizadas a 4 ° C) Añadir 50 l de cuentas Dynal a 1,5 ml microtubos de baja retención. Establecer un tubo de cuentas por inmunoprecipitación. Añadir una solución de bloques ml. Recoger cuentas con Dynal MPC. Colocar los tubos en bastidor magnético. Permitir cuentas a cobrar en el lado del tubo. Esto debe durar aproximadamente 15 s. Invertir en rack doble para ayudar a recoger perlas. Extraer el sobrenadante con pipeta. Añadir una solución de bloques ml y resuspender suavemente cuentas en la eliminación de la banda magnética de la rejilla y el bastidor de la inversión, con los tubos todavía en su lugar – ya sea de 10-20 veces, o hasta que los granos son uniformemente volver a suspender. Recoge bolas de arriba (paso 2). Extraer el sobrenadante con pipeta. Lávese las cuentas en 1,5 ml de solución de bloque, como en el paso 3, una vez más. Volver a suspender las bolas en 750 l de solución de bloques y añadir 10 mg de anticuerpo. Incubar a 4 ° C por un mínimo de 6 horas, o durante la noche, en un rotor. Lávese las cuentas de tres tIME en una solución de bloques ml, tal como se describe en el Paso 3. Sonicación celular Quitar pellets de células congeladas desde -80 º C y la transferencia de células a tubos de ultrasonidos. En la actualidad prefieren usar el fondo de un polupropylene estándar, 15 ml tubo cónico de ultrasonidos. Cortamos el tubo en dos piezas en la marca de 5 ml y desechar la mitad superior. Los tubos pueden ser cubiertos con parafilm o con la tapa del tubo mientras se prepara. El uso de un bastidor de tubo de microcentrífuga, tubo de posición para que la sonda se encuentra sonicador aproximadamente 0.5-1.0 cm por encima del fondo del tubo. Tenga cuidado de que la sonda está centrado y no en contacto con el lado del tubo. (Colocación de la sonda puede afectar si la solución de espuma o no durante la sonicación. Por lo general, la formación de espuma indica que el ADN sonicado se mal cortado.) Sonicar suspensión de 6 veces durante 20 s. Las muestras deben mantenerse en un baño de hielo-agua durante el tratamiento con ultrasonidos. Para disminuir la formación de espuma, inicialmente una potencia de salida a 0 y aumentar de forma manual para poder final durante la primera ráfaga. (Si no es importante la formación de espuma, las burbujas pueden ser removidos por centrifugación a 20.000 g seguida de resuspensión de todo el material suave, sin dejar burbujas de espuma.) Giran a 20.000 g durante 10 min a 4 ° C para los residuos de la cosecha de pellets y el sobrenadante en un tubo de 1,5 ml. Ahorre 50 l de lisado de células de cada muestra de ADN como de entrada. Almacenar a -20 ° C. Por lo menos una parte alícuota de ADN de entrada debe mantenerse por lote de lisado de ultrasonidos. Tenga en cuenta que los efectos de los efectos de los ultrasonidos y la consiguiente distribución de los tamaños de los fragmentos sólo se puede comprobar tras la reversión de reticulación y purificación del ADN. Inmunoprecipitación de cromatina Añadir la cantidad equivalente a la cromatina de 5 x 10 7 – 1 x 10 8 células de sonicación celular, el paso 4 a los 50 l / anticuerpo magnética mezcla de microesferas de Preparación de partículas magnéticas, Paso 6, con un volumen final de 1 ml (Se puede posible ajustar con buffer de lisis, si alguna vez). Incubar toda la noche en el rotador a 4 ° C. Lavar Recoger cuentas con Dynal MPC. Colocar los tubos en rack. Permitir cuentas a cobrar en el lado del tubo. Esto se debe tomar aproximadamente 20 s. Invertir en rack doble para ayudar a recoger todos los granos. Extraer el sobrenadante con pipeta, el cambio de puntas entre las muestras. Añadir 1 ml de tampón de lisis a cada tubo y volver a suspender las cuentas con cuidado. Esto se puede hacer mediante la eliminación de la banda magnética de la rejilla y el bastidor de la inversión, con los tubos todavía en su lugar – 20.10 horas o hasta que los granos se volvieron a suspender de manera uniforme. Recoger perlas. Aspirar el sobrenadante por pipeta. Repita este lavado 5 veces más, el cambio de puntas entre los mismos. Lávese las cuentas de 6 veces en 1 ml de Buffer IP1, tal como se describe en el Paso 2. Lávese las cuentas de 6 veces en 1 ml de tampón IP2, tal como se describe en el Paso 2. Lávese las cuentas de 6 veces en 1 ml de buffer TE 8.0, tal como se describe en el Paso 2. Giran a 960g durante 3 minutos a 4 ° C y retirar cualquier residuo de buffer TE. Elución Añadir 210 l de buffer de elución y el material de elución de cuentas mediante la incubación de los tubos en un baño de agua 65 ° C durante 15 min. Vortex brevemente cada 2 minutos. Esta incubación puede extenderse hasta 30 minutos, lo cual puede ayudar a mejorar la recuperación del eluido. Decantar cuentas a 16.000 g durante 1 min a temperatura ambiente. Eliminar 200 l de sobrenadante y transferir a un tubo nuevo. El material puede ser congelado a -20 ° C y almacenadas durante la noche. Reticular inversión Invertir reticular el ADN inmunoprecipitación de elución, el paso 3 mediante la incubación a 65 ° C durante un mínimo de 6 horas y un máximo de 15 horas (tiempos más largos de inversión de reticulación por lo general resultan en aumento de ruido en el análisis de microarrays). Esta incubación se puede hacer en un horno de modo que el tubo se calienta de manera uniforme y hay menos formado condensación. Descongele 50 l de ADN de entrada reservada después de la sonicación (Paso 13), añadir 150 l (3 volúmenes) de tampón de elución y mezclar. Revertir este entrecruzamiento de ADN de entrada mediante la incubación a 65 ° C como en la inversión Crosslink, Paso 1. Desde este punto, todos los tubos de inmunoprecipitación o ADN de entrada se considera que es un tubo separado o una muestra para su posterior procesamiento pasos. Purificación de ADN Añadir 8 l de 10 mg ml-1 RNAseA (0,2 mg ml de concentración-1 final), la mezcla de tiempos invirtiendo el tubo varias e incubar a 37 ° C durante 2 h. Agregar 4 l de 20 mg ml-1 proteinasa K (0,2 mg ml-1 de concentración final) y mezclar invirtiendo el tubo varias veces y se incuba a 55 ° C durante 2 h. Añadir 400 l de fenol: cloroformo: alcohol isoamílico (P: C: IA) y agitar y separar las fases con 2 ml tubo pesado Phaselock (siga las instrucciones proporcionadas por Eppendorf). Si el P: C: solución de IA es viejo o está a un pH bajo, habrá degradation de ADN, haciendo que el ruido en el análisis de microarrays y la pérdida de la detección de objetivos válidos. Transferencia de fase acuosa a un tubo de centrífuga que contiene 16 nuevas l de NaCl 5M (200 mM) concentración final) y 1,5 l de 20 μ l-1 de glucógeno (30 en total mg). Añadir 800 l EtOH. Incubar durante toda la noche a -20 ° C o 30 minutos a -80 ° C. Giran a 20.000 g durante 10 min a 4 ° C para precipitar el ADN. Lávese las pastillas por la adición de 500 l de 80% EtOH, vortex para resuspender sedimento y girar de nuevo a 20.000 g por 5 min a 4 ° C. Eliminar cualquier EtOH 80% restante. Girar los tubos brevemente para recoger el líquido restante y remover el líquido con una pipetteman, evitando los pellets. Permita que el aire seco hasta que los tubos de gránulos secos son: pellets aún deben conservar un aspecto húmedo. Resuspender cada pellet en 70 l de 10 mM Tris-HCl, pH 8,0. Secado en exceso de estas pastillas pueden hacer que sea difícil para volver a suspender, o susceptibles de escamas y se desprenden de la pared del tubo. Opcional: Save 15 l de muestra inmunoprecipitación para uso futuro. Este material puede utilizarse para realizar los genes específicos de la confirmación por PCR de los resultados de microarrays. Cuantificar la concentración de absorción de rayos UV (260 nm). NB: Los siguientes pasos, incluida la preparación de la biblioteca y la amplificación de utilizar una versión modificada de GenomePlex WGA kit con Amp Mix 10 veces más de Sigma sin dNTPs: Biblioteca de la preparación Disponible en el kit GenomePlex Ventajas de Windows Original Mix Amp con 10 veces más de Sigma Añadir 2 l de 1X Buffer Preparación Biblioteca a 10 l de muestra de ADN de la purificación de ADN, el paso 11 en un tubo de PCR. Añadir 1 l de solución de Estabilización de la Biblioteca. Vortex a fondo, consolidar mediante centrifugación, y el lugar en el termociclador a 95 ° C durante 2 minutos. Enfriar la muestra en hielo, consolidar mediante centrifugación por centrifugación, y luego regresar al hielo. Añadir 1 l de preparado enzimático Biblioteca, vórtice de fondo, y después centrifugar brevemente. Coloque la muestra en un termociclador e incubar la siguiente manera: 16 ° C durante 20 minutos 24 ° C durante 20 minutos 37 ° C durante 20 minutos 75 ° C durante 5 minutos 4 ° C tienen Muestras de los termociclador y una breve centrifugación. Las muestras pueden ser amplificadas inmediatamente o almacenarse a 20 ° C durante tres días. Amplificación Disponible en el kit GenomePlex Ventajas de Windows Original Mix Amp con 10 veces más de Sigma Una mezcla maestra se prepara añadiendo los siguientes reactivos a la reacción de 15 ul en el paso 3, a continuación: 7,5 l de mezcla Amp 10 veces (sin dNTPs) 5,0 l de Ventajas de Windows Original ADN polimerasa 3,0 l de un dNTP 10 mM (cada uno) de acciones (concentración final 0,4 mM) Alcanzar un volumen final de reacción de 75 ml con agua libre de nucleasa Vortex a fondo. Centrifugar brevemente, y comenzar a termociclado. Desnaturalización inicial 95 ° C durante 3 minutos Realizar 14 ciclos de la siguiente manera: Desnaturalizar 94 ° C durante 15 segundos Recocido / Extender 65 ° C durante 5 minutos Después de completar el ciclismo es, mantener las reacciones a 4 ° C o almacenar a -20 ° C hasta que esté listo para su análisis o purificación. Purificar el ADN con PCR Purificación Kit ® de Quiagen de acuerdo a las instrucciones del fabricante y cuantificar la concentración de absorción de rayos UV (260 nm). Realizar de nuevo un ciclo de amplificación de la preparación de la Biblioteca, a través de un paso de amplificación, el paso 2, con las siguientes adaptaciones. • En cuanto a la cantidad de ADN que se requiere desde el paso 3, arriba, para iniciar el proceso de fragmentación: Si la concentración de ADN es de alrededor de 200-300 mg / ml, uso de 2,5 l de muestra y ajustar con el agua para un volumen final de 10 microlitros. Si la concentración de ADN es de alrededor de 50-60 g / ml, usar 5 l de la muestra y ajustar con el agua para un volumen final de 10 microlitros. • En este proceso de segunda amplificación, dNTPs con dTTPs para la mezcla principal es a cambio de una mezcla entre mM dATP 10, 10 mM dGTP, dCTP 10 mM y 8 mM dTTP y 2 mM dUTP a la misma concentración que la mezcla anterior. Medida ADN utilizando Espectrofotómetro UV-VIS (260 nm). Por lo general, superior a 9 g de ADN amplificados se obtiene de cada reacción. NB: El etiquetado de los objetivos de ADN se realiza con el GeneChip ® WT doble cadena de ADN Kit Terminal Etiquetado de Affymetrix de acuerdo a las instrucciones del fabricante, tal como se describe a continuación: Fragmento amplificado objetivos Fragmento de la muestra utilizando la tabla correspondiente más abajo dependiendo de lo que la matriz de tipo objetivo será híbridozado para. Tabla 1. Mezclar la fragmentación de las matrices individuales Componente de volumen / cantidad en un Rxn ADN de doble cadena 7,5 mg 10 veces la fragmentación cDNA 4,8 l UDG, 10 U / l 1,5 l APE 1, 100 U / l 2,25 l Agua libre de nucleasas hasta 48 l Disponibles en el GeneChip ® WT doble cadena de ADN Kit Etiquetado Terminal de Affymetrix Tabla 2. La fragmentación Mix para los conjuntos de serie multi- Componente de volumen / cantidad en un Rxn ADN de doble cadena 9 mg 10 veces la fragmentación cDNA 4,8 l UDG, 10 U / l 1,5 l APE 1, 100 U / l 2,25 l Agua libre de nucleasas hasta 48 Disponibles en el GeneChip ® WT doble cadena de ADN Kit Etiquetado Terminal de Affymetrix Establecer la mezcla de acuerdo a la fragmentación ya sea por encima de las tablas. Flick-mezclar y centrifugar los tubos. Incubar las reacciones en: 37 ° C durante 1 h. 93 ° C durante 2 min. 4 ° C durante al menos 2 minutos. Flick-mix, la desaceleración de los tubos, y la transferencia de 45 l de la muestra a un tubo nuevo. Quite los 2 l de cada muestra para su análisis en gel de turno. Etiqueta fragmentada ADN de doble cadena Prepare la mezcla de ADN de cadena doble etiquetado como se describe en la siguiente tabla: Tabla 3. Composición de la doble hélice del ADN Mix etiquetado Componente de volumen / cantidad en un Rxn Buffer 5X TDT 12 l TDT 2 l ADN reactivo etiquetado, 5 mm 1 l El volumen total de 15 l Disponibles en el GeneChip ® WT doble cadena de ADN Kit Etiquetado Terminal de Affymetrix Añadir 15 ul de la mezcla de ADN de cadena doble etiquetado de las muestras de ADN, película de mezcla, y el giro hacia abajo. Incubar las reacciones en: 37 ° C durante 60 min. 70 ° C durante 10 min. 4 ° C durante al menos 2 min. Quite los 2 l de cada muestra para su análisis en gel de turno. Gel de cambio de análisis Preparar un 4% en gel de agarosa. Incubar las muestras de los objetivos de los fragmentos amplificados, Paso 5 y etiqueta de fragmentación ADN de doble cadena, el paso 4 a 65 ° C durante 2 min. Añadir 10 l de estreptavidina (1 mg / ml), y las muestras se incuban a temperatura ambiente durante 5 min. Ejecutar las muestras desde el paso 3 en un 4% en gel de agarosa (Gel de cambio de análisis, paso 1) para comprobar el cambio de la migración de los productos de etiquetado. Matriz de la hibridación y el lavado de matriz Realizado por el Centro de Genómica de la Universidad de California Riverside. Matriz de análisis Realizada por análisis computacional. COMPOSICIONES BUFFER: Bloquear Solución: PBS + 0,5% albúmina de suero bovino (BSA). Tampón de lisis: 50 mM HEPES-KOH, pH 7,5 140 mM NaCl 1 mM EDTA 1% de Triton X-100 SDS al 0,1% 1mM PMSF PH final de 7,5 IP1: tampón de lisis + 500 mM NaCl IP2: 10 mM Tris-HCl 250 mM LiCl 1 mM EDTA 0,5% NP-40 0,5% de sodio Dioxycholat PH final de 8,0 TE: 10 mM Tris, pH 7,4 1 mM EDTA PH final de 8,0 Buffer: buffer TE + 1% de SDS.