מטריצת קרום מרתף צבירת תאים עטופה לחקר היווצרות רקמת טחול מורין
Özet
מאמר זה מתאר פרוטוקול לצבירה ומעטפת של תאי טחול בתוך מטריצת קרום מרתף מוצקה למחצה. מבני מטריצת קרום מרתף יכולים לשמש בתרבית תלת ממדית לחקר התפתחות אורגנואידים, או למחקרי השתלות in vivo והתחדשות רקמות.
Abstract
הטחול הוא איבר חיסוני הממלא תפקיד מפתח בתגובות חיסוניות המועברות בדם. אובדן אנטומי או פונקציונלי של רקמה זו מגביר את הרגישות לזיהומים חמורים בדם ואלח דם. השתלה אוטומטית של פרוסות טחול שימשה קלינית להחלפת רקמות שאבדו ולשיקום תפקוד מערכת החיסון. עם זאת, המנגנון המניע התחדשות חזקה ומתפקדת אימונולוגית של רקמת הטחול לא הובהר במלואו. כאן, אנו שואפים לפתח שיטה לצבירה ומעטפת של תאי טחול בתוך מטריצה מוצקה למחצה על מנת לחקור את הדרישות התאיות להיווצרות רקמת הטחול. מבני תאים עטופים במטריצת קרום מרתף מקובלים הן על תרבית רקמת מבחנה של אורגנואידים תלת מימדיים והן על השתלה תחת קפסולת הכליה כדי להעריך ישירות את היווצרות רקמת vivo . על ידי מניפולציה של תאי הקלט לצורך צבירה ואנקפסולציה, אנו מראים כי תאי סטרומה ילודים PDGFRβ+MAdCAM-1– שמקורם בשתלים נדרשים להתחדשות רקמת הטחול תחת מודלים של השתלות בעלי חיים.
Introduction
קרע טראומטי של הטחול והופעת גושים טחול מרובים בגוף היה אחד הסימנים הראשונים לכך שרקמת הטחול הייתה בעלת יכולת התחדשות 1,2. השתלות אוטומטיות של טחול הוכנסו מאוחר יותר למרפאה כדי לשמר את רקמת הטחול בחולים הזקוקים לכריתת טחול דחופה3. עם זאת, למרות היותו חלק מהפרקטיקה הקלינית במשך עשרות שנים, מעט מאוד ידוע על האופן שבו הטחול מתחדש. מודלים להשתלות בעלי חיים סיפקו תובנה לגבי פרמטרים רבים של התחדשות הטחול ותפקוד מערכת החיסון 4,5. בפרט, שינויים ניסיוניים בשיטת הכנת השתל אפשרו להתחדשות רקמות להיחקר בפירוט רב יותר ברמה התאית והמולקולרית.
השתלות המערבות פרוסות טחול שלמות עוברות שלב של נמק המוני לפני שמבנה טחול חדש נבנה מחדש6. השלב הראשוני של נמק השתל מצביע על כך שרוב הרקמה המושתלת מורכבת בעיקר מתאי דם אדומים ולבנים והיא מיותרת להתחדשות הטחול. זה נחקר באופן ניסיוני על ידי אי הכללת תאים hematopoietic משתלי טחול לפני ההשתלה תחת כמוסת הכליה עכבר. כאן, החלק שאינו לויקוציטים / לא אריתרוציטים של הטחול, הכולל תאי סטרומה ואנדותל, הוכח כמספיק כדי לגרום להיווצרות רקמת דה נובו 7. רקמת סטרומה של הטחול יכולה להיות מעובדת עוד יותר לתרחיף של תא יחיד, מה שיאפשר שימוש בטכנולוגיות מיון תאים כדי לתפעל את הרכב השתל התאי. על ידי הסרה סלקטיבית של סוגי תאים מועמדים, זוהו שתי אוכלוסיות תאי סטרומה CD45-TER-119 שהיו חיוניות לפיתוח שתלים: אוכלוסיית תאים דמוית אנדותל CD31+CD105+MAdCAM-1+ ואוכלוסיית תאים מזנכימליים PDGFRβ+ מוגדרת באופן רחב יותר8.
בניית שתלים מתאי הטחול משתנה מבחינת חומרי תמיכה ותהליכי העמסת תאים. טחול מהונדס רקמות הוכנו בעבר על ידי העמסת יחידות ספלניות על פיגום פולימרי חומצה פוליגליקולית/חומצה לקטיתפולי-L 5,9. באופן מעניין, תאי סטרומה של הטחול שנספגו בספוג קולגן לא הצליחו להיקלט, בעוד שתאי סטרומה שהצטברו והועמסו על יריעת קולגן סייעו להתחדשות הטחול8. השעיה של תאי סטרומה בטחול בתוך מטריצת מטריג’ל הוכחה גם כגורמת לצבירת תאים בתנאי תרבית תלת ממדית10. עם זאת, שיטה זו לא נבדקה לשימוש במודלים להשתלה. המטרה הכוללת של הפרוטוקול הנוכחי היא לצבור ולעטוף בכוח תאי סטרומה של הטחול ישירות בתוך מטריצת קרום המרתף, אשר לאחר מכן יכולים להיות מועברים למערכת תלת-ממדית של תרביות רקמה חוץ גופית או לשמש ככלי להשתלות מודל של בעלי חיים (איור משלים 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
הצבירה של תאי טחול בילודים בתוך תווך מוצק למחצה מייצגת שיטה בת קיימא ליצירת מבני טחול. פרוטוקולים דומים מבוססי ממברנות מרתף שימשו ליזום תרביות טחול תלת ממדיות10. כאן, אנו מראים כי מבני הטחול מתאימים באותה מידה למערכות תרבית אורגנואידים במבחנה , כמו גם למודלים של השתלת in …
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי המועצה הלאומית לבריאות ומחקר רפואי של אוסטרליה (#GNT1078247).
Materials
| 96 Well Polypropylene 1.2 mL Cluster Tubes | Corning | CLS4401 | For placing inside a 14 ml conical tube |
| B-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | Stock 55 mM, use at 50 uM |
| Collagenase D | Roche | 11088858001 | |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138 | From Clostridium histolyticum |
| Deoxyribonuclease I (DNase I) | Sigma-Aldrich | D4513 | Deoxyribonuclease I from bovine pancreas,Type II-S, lyophilized powder, Protein ≥80 %, ≥2,000 units/mg protein |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | 4500 mg/L Glucose, L-Glutamine, and Sodium Bicarbonate, without Sodium Pyruvate, Liquid. Sterile Filtered. |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | Without calcium chloride and magnesium chloride, sterile-filtered |
| Eclipse 200 μl Pipette Tips | Labcon | 1030-260-000 | Bevel Point |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-079 | Lot# 1382243 |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | Stock 100X, use at 1X |
| Matrigel | Corning | 354263 | Matrigel matrix basement membrane High Concentration, Lot# 7330186 |
| MEM Non-essential Amino Acids | Gibco | 11140076 | Stock 100X, use at 1X |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | Stock 10,000 units/ml Penicillin, 10,000 ug/ml Streptomycin |
| Reversible Cell Strainer | STEMCELL Technologies | 27216 | 70 μm |
| Ring Tweezers | NAPOX | A-26 | Ring size: 3 mm |
| Rock Inhibitor (Y-27632) | MedChemExpres | HY-10071 | |
| Thermofisher Heraeus Megafuge 40R Centrifuge | Thermofisher | Acceleration and deceleration speeds were set to 8 | |
| Ultra Fine Tweezers | EMS | 78340-51S | Style 51S. Antimagnetic/anti-acid SA low carbon austenitic steel tweezers are corrosion resistant. Anti-glare satin finish. |
| Vicryl 5/0 Suture Ligapak Reel | Ethicon | J283G | |
| Wiretrol II Long Wire Plunger | Drummond | 5-000-2002-L | Stainless Steel Plunger, 25 & 50 μL/WRTL II, Long |
| Wound Clip Applier | MikRon | 427630 | |
| Wound Clips | MikRon | 427631 | 9 mm |
Referanslar
- Jarcho, S., Andersen, D. Traumatic autotransplantation of splenic tissue. American Journal of Pathology. 15 (5), 527-546 (1939).
- Storsteen, K. A., ReMine, W. Rupture of the spleen with splenic implants: splenosis. Annals of Surgery. 137 (4), 551-557 (1953).
- Mizrahi, S. Posttraumatic autotransplantation of spleen tissue. Archives of Surgery. 124 (7), 863 (1989).
- Miko, I., et al. Spleen autotransplantation. Morphological and functional follow-up after spleen autotransplantation in mice: A research summary. Microsurgery. 27 (4), 312-316 (2007).
- Grikscheit, T. C., et al. Tissue-engineered spleen protects against overwhelming Pneumococcal sepsis in a rodent model. Journal of Surgical Research. 149 (2), 214-218 (2008).
- Pabst, R., Westermann, J., Rothkotter, H. Immunoarchitecture of regenerated splenic and lymph node transplants. International Review of Cytology. 128, 215-260 (1991).
- Tan, J. K. H., Watanabe, T. Murine spleen tissue regeneration from neonatal spleen capsule requires lymphotoxin priming of stromal cells. The Journal of Immunology. 193 (3), 1194-1203 (2014).
- Tan, J. K. H., Watanabe, T. Stromal cell subsets directing neonatal spleen regeneration. Scientific Reports. 7 (1), 40401 (2017).
- Gee, K., et al. Spleen organoid units generate functional human and mouse tissue-engineered spleen in a murine model. Tissue Engineering Part A. 26 (7-8), 411-418 (2020).
- Ueno, Y., et al. Transcription factor Tlx1 marks a subset of lymphoid tissue organizer-like mesenchymal progenitor cells in the neonatal spleen. Scientific Reports. 9 (1), 20408 (2019).
- . Online data repository: Matrigel encapsulated cell aggregation for investigating murine spleen tissue formation Available from: https://osf.io/ehrbw/?view_only=7d6a8e05c84144d3a12d36ffe7f94f01 (2023)
