Isolement, expansion et nucléofection de cellules souches neurales de la zone sous-ventriculaire murine adulte

Toutes les expériences réalisées sur des animaux ont été préalablement approuvées par le Comité d’éthique de l’Université de Valence et autorisées par la Conselleria de Agricultura, Ganadería y Pesca, Generalitat Valenciana (Espagne). 1. Culture primaire des neurosphères Préparation des réactifsPréparez une solution tampon de tampon salin phosphate de Dulbecco (DPBS) dans de l’eau désionisée et stérilisez par autoclavage. Vous pouvez également préparer une solution de PBS de pH 7,4 de 0,1 M en ajoutant une solution de 137 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 10 mM de Na2HPO4 et 1,8 mM de KH2PO4 dans de l’eau désionisée. Remplissez deux plaques à 12 puits avec des DPBS préalablement refroidis et conservez-les sur de la glace : l’une sera utilisée pour préserver l’ensemble du cerveau avant la dissection, et l’autre préservera les SVZ disséquées jusqu’au traitement des tissus. Préparez un mélange enzymatique contenant de la papaïne comme décrit ci-dessous.Préparer une solution de dissociation EDTA/L-cystéine dans une solution saline équilibrée Earl’s (EBSS) jusqu’à une concentration finale de 0,2 mg/mL chacune. Pour obtenir une dissolution complète, incubez le tube dans un bain-marie à 37 °C. Dissoudre 12 U/mL de papaïne dans une solution d’EDTA/L-cystéine. Considérez que 500 μL de solution enzymatique seront utilisés par cerveau. Introduire la solution de papaïne dans un bain-marie à 37 °C pendant environ 20 minutes jusqu’à ce que l’enzyme se dissolve complètement. Stérilisez le mélange enzymatique à l’aide d’une seringue et d’un filtre à pores de 0,22 μm et maintenez-le à 4 °C jusqu’à utilisation.REMARQUE : Papain s’active après 30 min à 37 °C et peut être stocké pendant 12 h à 4 °C. Préparez le milieu de culture témoin en ajoutant la solution de mélange d’hormones conformément au tableau 1 et stérilisez-le par filtre à l’aide de filtres à pores de nitrocellulose de 0,22 μm. Maintenez le fluide à 4 °C et réchauffez-le au bain-marie à 37 °C avant utilisation. Préparez le milieu complet en complétant le milieu témoin avec de l’EGF et du bFGF juste avant de l’utiliser, conformément au tableau 1. Ne filtrez pas tout le milieu, car les mitogènes peuvent être perdus lors du filtrage. Extraction cérébrale et dissection de la SVZREMARQUE : Les souris ont libre accès à la nourriture et à l’eau avant l’euthanasie. On utilise des souris C57BL/6 âgées de 8 à 16 semaines. Les deux sexes sont utilisés sans différences notables dans la préparation.Stérilisez les outils de dissection par autoclave avant la chirurgie. Ensuite, immergez des scalpels, des pinces à épiler, des ciseaux et des spatules dans un bécher rempli à 70 % d’éthanol. Nettoyez soigneusement chaque surface de travail avec de l’éthanol à 70 %. Sacrifiez la souris par surdosage de CO2 et confirmez par luxation cervicale. Vaporisez la tête avec de l’éthanol à 70 % pour minimiser le risque de contamination des tissus cérébraux. Séparez la tête de la souris du reste du corps à l’aide de ciseaux. Coupez la peau au-dessus du crâne avec de petits ciseaux le long de l’axe rostro-caudal, jusqu’à ce que le crâne soit complètement découvert. Exposez le cerveau en coupant d’abord le crâne le long de la suture sagittale avec de petits ciseaux, puis retirez les os à l’aide d’une pince à épiler fine. Veillez à ne pas causer de dommages au tissu cérébral sous le crâne lors de cette étape. Extrayez soigneusement le cerveau du crâne à l’aide d’une spatule et placez-le dans une plaque à 12 puits contenant du DPBS froid. Gardez la plaque sur de la glace jusqu’à ce que la dissection soit terminée. Transférez tout le cerveau sur le tampon de silicium où la dissection aura lieu et appliquez quelques gouttes de DPBS froid sur le cerveau (Figure 1A). À l’aide d’un scalpel, on enlève l’OB situé à l’extrémité rostrale du cerveau et le cervelet situé dans la partie caudale tout en conservant la partie centrale du cerveau contenant les deux ventricules latéraux (Figure 1B). Divisez le cerveau le long de la fissure longitudinale en deux hémisphères, puis procédez à la dissection des deux hémisphères séparément (Figure 1C). En travaillant avec un hémisphère, réorientez-le de manière à ce que la zone médiane soit tournée vers le haut. Ouvrez le cerveau le long de la ligne du corps calleux, séparant le cortex et le striatum de l’hippocampe, du septum et du diencéphale, exposant ainsi les ventricules latéraux (Figure 1D).REMARQUE : La SVZ est située entre la cavité du ventricule et le striatum, de sorte que les étapes suivantes visent à isoler la SVZ aussi précisément que possible des tissus environnants. Retirez l’hippocampe, le septum et le diencéphale en suivant la limite ventrale des ventricules (Figure 1E, F), le tissu au-delà des extrémités rostrale et caudale de la SVZ (Figure 1G) et le cortex suivant le corps calleux (Figure 1H, I). Inclinez le tissu de manière à ce que la ZVS soit tournée vers le côté (Figure 1J), ce qui permet d’enlever le tissu striatal sous la ZVS (Figure 1K) pour obtenir un mince morceau de tissu contenant les CSN (Figure 1L). Stockez les deux SVZ disséquées de la même souris dans une plaque à 12 puits contenant des DPBS froids et stériles jusqu’à ce que le traitement des tissus commence.REMARQUE : La dissection des deux SVZ d’un cerveau devrait prendre 10 min. Un temps plus long peut affecter la viabilité cellulaire. Si un rendement accru des cultures est nécessaire, les SVZ de plusieurs souris du même âge, du même sexe, du même patrimoine génétique et du même génotype peuvent être regroupées. Isolement et ensemencement des CSNCoupez chaque SVZ en 4-5 petits morceaux pour faciliter la désagrégation du tissu.REMARQUE : À partir de cette étape, l’ensemble de la procédure doit être effectué dans des conditions stériles dans une hotte à flux laminaire. Transférez les SVZ hachés dans un tube à centrifuger de 15 mL à l’aide d’une pipette Pasteur en plastique stérile. Assurez-vous qu’il ne reste aucun fragment dans l’assiette. Laissez le tissu sédimenter au fond du tube et retirez le DPBS restant. Ajouter 500 μL de mélange enzymatique filtré contenant de la papaïne par cerveau (2 SVZ) et incuber les tubes dans un bain-marie à 37 °C pendant 30 min. Après l’incubation, ajouter 5 mL de milieu témoin préchauffé à 37 °C à chaque échantillon. Centrifuger les échantillons à 300 x g pendant 5 min. Ensuite, retirez délicatement le surnageant à l’aide d’une micropipette ou d’une pompe à vide. Ajouter 1 mL de milieu témoin et désagréger soigneusement mécaniquement la pastille, en pipetant de haut en bas de 10x à 20x, à l’aide d’une pipette en verre Pasteur polie au feu jusqu’à l’obtention d’une suspension cellulaire homogène.ATTENTION : Il s’agit de l’une des étapes les plus critiques du protocole, car une désagrégation excessive ou insuffisante affectera négativement le rendement des cultures. Ajouter 4 mL de milieu témoin et mélanger par inversion pour laver les cellules. Centrifugeuse à 300 x g pendant 5 min. Ensuite, retirez le surnageant. Ajouter 1 mL de milieu complet et remettre la pastille en suspension en pipetant de haut en bas 10 fois pour homogénéiser la suspension cellulaire. Comptez la suspension cellulaire à l’aide d’une chambre Neubauer sous le microscope après avoir dilué 1/2 une aliquote de la suspension cellulaire avec du bleu de trypan ou utilisez un compteur automatique de cellules. Assurez-vous que les cultures sont désagrégées au niveau de la cellule unique. Une fois la suspension cellulaire préparée, ensemencez les cellules obtenues également dans 8 puits d’une plaque de 48 puits dans un volume final de 500 μL de milieu complet.REMARQUE : Nous obtenons habituellement 20 000 cellules de deux ZV, ce qui donne une densité de semis finale d’environ 2 500 cellules/mL pour obtenir le rendement maximal en cultures. Formation des neurosphèresIncuber des cellules pendant 5 à 7 jours in vitro (DIV) dans un incubateur humidifié à 37 °C et 5% de CO2. Dans ces conditions, les cellules différenciées meurent tandis que les NSC et les progéniteurs prolifèrent en réponse à la stimulation mitogénique, formant des agrégats clonaux reconnus comme des neurosphères primaires.REMARQUE : EGF ou bFGF peuvent être utilisés pour induire la formation de neurosphères. Cependant, ces deux facteurs de croissance ne sont pas entièrement substituables. Vérifiez la taille des neurosphères à l’aide d’une caméra couplée à un microscope inversé, et une fois que les neurosphères atteignent une plage de taille de 50 à 100 μm, comptez toutes les neurosphères primaires formées dans le puits à un grossissement de 10x. Le nombre total de neurosphères primaires formées sert d’estimation du nombre de NSC présentes dans la niche SVZ. Après une période de 10 jours, prélever le milieu de culture de chaque puits pour commencer le passage. Effectuez un passage ultérieur après 5 à 7 DIV, bien qu’il soit intéressant de noter que les sphères primaires peuvent nécessiter une durée légèrement plus longue pour atteindre la taille idéale pour la sous-culture (environ 100 μm). Tableau 1 : Solutions de milieux de culture. La recette du milieu de contrôle est décrite. Une solution de mélange d’hormones pré-mélangée est fabriquée. Les solutions hormonales mères peuvent être préparées à l’avance comme indiqué et conservées à -20 °C. Avant la culture cellulaire, complétez le milieu témoin avec de l’EGF et du bFGF pour préparer un milieu complet. Les spécifications de stockage, les stocks et les concentrations de travail sont fournis pour chaque composant. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau. 2. L’expansion des cultures de la neurosphère Passage des neurosphèresPrélever le milieu contenant les neurosphères des plaques multipuits et les transférer dans un tube à centrifuger de 15 ml. Assurez la récupération d’un maximum de cellules en rinçant les puits avec quelques millilitres de DPBS. Centrifuger les neurosphères pendant 5 min à 300 x g. Ensuite, retirez le surnageant. Ajoutez 200 μL de solution enzymatique (voir Tableau des matériaux) à la pastille et tapotez doucement le fond du tube pour la déloger. Incuber 10 min à température ambiante pour faciliter la dissociation des neurosphères. Ajouter 1 mL de milieu témoin pour arrêter la réaction enzymatique et dissocier mécaniquement les neurosphères avec une micropipette P1000 en pipetant de haut en bas de 10x à 20x. Ajouter un volume supplémentaire de 4 mL du milieu témoin et mélanger par inversion pour laver les cellules. Centrifuger les cellules pendant 5 min à 300 x g. Ensuite, retirez le surnageant. Ajouter 1 mL de milieu complet et remettre la pastille en suspension pour homogénéiser la suspension cellulaire en pipetant de haut en bas 10x.REMARQUE : Si le nombre et la taille d’origine des neurosphères sont trop élevés, ajoutez plus de milieu complet pour diluer la suspension cellulaire assurant un nombre fiable de cellules. Comptez la suspension cellulaire à l’aide d’une chambre Neubauer après avoir dilué 1/2 une aliquote de la suspension cellulaire avec du bleu trypan ou utilisez un compteur automatique de cellules. Pour élargir la culture cellulaire, semez des cellules à une densité de 10 000 cellules/cm2 en utilisant un milieu complet dans une plaque ou un flacon de culture approprié (voir tableau 2). Incuber des cellules pour 5 à 7 DIV dans un incubateur humidifié à 37 °C et 5% de CO2 pour chaque passage.REMARQUE : Les cultures de la neurosphère peuvent être constamment étendues et propagées par des sous-cultures répétées, ne dépassant pas 10 passages, sans altérer leurs capacités de prolifération. L’EGF ou le bFGF peuvent être utilisés pour la culture ; cependant, l’expansion à long terme des cultures ne peut être réalisée qu’en présence du FEM. Test d’auto-renouvellementAprès avoir passé des cultures de neurosphère, mettez en plaque 1 000 cellules individuelles dans une plaque de 96 puits, complétant jusqu’à un volume final de 200 μL avec un milieu complet, ce qui donne une densité cellulaire finale des cultures de 5 cellules/μL.REMARQUE : Le nombre de cellules ensemencées doit être aussi précis que possible. Si nécessaire, préparez des dilutions intermédiaires pour assurer un volume de suspension cellulaire fiable avant le placage. De plus, il est recommandé de plaquer 4 à 5 répétitions par condition pour réduire la variabilité technique. Incuber des cellules à 37 °C et 5 % de CO2 dans un incubateur humidifié pendant 5 jours ou jusqu’à ce que les neurosphères atteignent une taille adéquate (60 à 100 μm). Évitez de déplacer ou de secouer la plaque multipuits pour éviter l’agrégation de la neurosphère. Après la formation des neurosphères, comptez le nombre de neurosphères formées dans chaque puits à l’aide d’un microscope à contraste de phase inversé équipé d’une caméra attachée. Le test d’auto-renouvellement peut être effectué séparément à l’aide de l’EGF ou du bFGF. Cryoconservation des cultures de NSCREMARQUE : Les cultures de la neurosphère peuvent être cryoconservées pour une utilisation future, minimisant ainsi le nombre de souris nécessaires. Nous recommandons de conserver les cellules jusqu’au passage 10.Pour cryoconserver les cellules, transférez 1 mL de la suspension cellulaire dans un milieu complet dans un cryotube correctement étiqueté. Ajoutez du diméthylsulfoxyde (DMSO) à une concentration finale de 10 % à la suspension cellulaire et mélangez doucement en inversant les tubes.REMARQUE : Le DMSO sert de cryoprotecteur mais peut être toxique pour les cellules, donc cette étape doit être effectuée rapidement. Placez les tubes dans un congélateur à -80 °C à l’aide d’un récipient de congélation qui permet une diminution progressive de la température à 1 °C/min. Ce processus de congélation progressive permet d’éviter les dommages cellulaires causés par la formation de cristaux de glace lors de la cryoconservation. Pour un stockage à long terme, maintenez les tubes dans un réservoir d’azote liquide à -196 °C. Décongélation des cultures NSCREMARQUE : Au besoin, les cellules peuvent être décongelées et les cultures peuvent être agrandies à nouveau pour les expériences.Retirez les cryotubes contenant des NSC congelés du réservoir de stockage d’azote liquide et placez-les immédiatement dans un bain-marie à 37 °C jusqu’à ce qu’ils soient complètement décongelés, environ 5 min.ATTENTION : Il est crucial de minimiser le temps de bain car le DMSO est toxique et peut affecter la viabilité cellulaire. Transférez rapidement les cellules décongelées dans un tube à centrifuger de 15 mL contenant 5 mL de milieu témoin préchauffé. Centrifugez les cellules à 300 x g pendant 5 min et retirez le surnageant. Ajouter 1 mL de milieu complet et remettre la pastille en suspension en pipetant doucement de haut en bas 10 fois pour homogénéiser la suspension cellulaire avant l’ensemencement.REMARQUE : La décongélation peut affecter la viabilité cellulaire ; Par conséquent, il est recommandé de passer les cellules au moins une fois avant de les ensemencer pour de nouvelles expériences. Test des mycoplasmesREMARQUE : La contamination par les mycoplasmes peut compromettre la santé des cellules, affectant les taux de croissance. Par conséquent, l’analyse des mycoplasmes est cruciale pour garantir l’intégrité et la fiabilité des expériences.Extraction de l’ADNPrélever un minimum de 100 μL de la culture cellulaire pour l’extraction de l’ADN. Le surnageant et la pastille cellulaire peuvent être utilisés pour l’extraction de l’ADN. Conservez cette aliquote à -20 °C jusqu’à l’extraction. Percez le couvercle du tube et faites bouillir l’aliquote à 99 °C pendant 15 min à l’aide d’un thermobloc.REMARQUE : Le perçage des couvercles des tubes empêche l’ouverture des tubes lors de l’ébullition à haute température. Centrifugeuse pendant 5 min à 16 900 x g. Transférez le surnageant contenant l’ADN dans un nouveau tube. Conservez le tube contenant l’ADN à -20 °C jusqu’au test PCR. PCR pour la détection des mycoplasmesPréparez le mélange PCR à l’aide des composants suivants : 8,9 μL d’eau exempte de nucléases, 3 μL de tampon réactionnel 5x, 1,2 μL de 25 mM de MgCl2, 0,25 μL de 2,5 mM de dNTPs, 0,15 μL de Taq polymérase et 0,25 μL de chaque amorce spécifique du mycoplasme à une concentration de 10 μM (Forward, Fw : 5’GATGTTTAGCCGGGTCGAGAG3′ et Inverse, Rv : 5’GATGTCAAGAGTGGGTAAGGTT3′). Ajouter 1 μL d’ADN génomique extrait. Préparez le mélange PCR dans une hotte à flux laminaire pour éviter la contamination de l’ADN. Incuber la réaction dans un thermocycleur comme suit : dénaturation initiale à 95 °C pendant 5 min suivie de 35 cycles de dénaturation à 95 °C pendant 30 s, de recuit à 53 °C pendant 1 min, d’extension à 72 °C pendant 30 s et d’extension finale à 72 °C pendant 5 min. Pour identifier la taille de la bande résultante (environ 500 pb), chargez 15 μL du produit PCR d’ADN mélangé à 3 μL de solution de colorant de chargement 6x sur un gel d’agarose à 2 % et exécutez l’électrophorèse pendant 40 à 50 min à 100 V. Tableau 2 : Plaques et flacons utilisés pour la culture. Les dimensions et les volumes des plaques et des flacons de semis les plus couramment utilisés sont fournis. Le tableau comprend le diamètre, l’aire de croissance et le volume moyen utilisés pour chaque récipient, ainsi qu’un exemple du nombre de CSN à ensemencer dans des conditions d’expansion (10 000 cellules/cm2). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau. 3. Nucléofection des cultures de la neurosphère Préparation des réactifsPréparation de l’ADNPréparez 25 μL de cellules DH5α d’E. coli compétentes dans un tube de 1,5 mL pour la transformation. Ajouter 1 μL du plasmide d’intérêt (à 100 à 200 ng/μL) aux cellules et les soumettre à un choc thermique à 42 °C pendant 45 s. Ici, un plasmide contenant un (sh)RNA en épingle à cheveux courte pour réduire au silence l’expression de Snrpn et un plasmide témoin shSCRAMBLE sont utilisés.REMARQUE : Gardez les cellules compétentes sur la glace tout au long de la procédure pour maintenir l’efficacité de la transformation. Plaquez les cellules transformées sur des plaques de gélose LB avec l’antibiotique approprié et incuberez-les à 37 °C pendant 18 h. Gardez les boîtes de Pétri inversées pour éviter la formation de gouttelettes dues à la condensation, qui pourraient perturber les colonies bactériennes.REMARQUE : Ajouter des antibiotiques appropriés au milieu de culture LB pour permettre exclusivement la croissance des bactéries transformées. À l’aide d’une pointe de pipette stérile, prélever des colonies bactériennes individuelles et les transférer dans un erlenmeyer préalablement rempli de 250 mL de LB pour initier une culture liquide. Évitez de choisir de petites colonies satellites positionnées autour des grandes colonies cibles, car elles n’auraient peut-être pas incorporé le plasmide souhaité. Incuber le ballon en l’agitant vigoureusement sur un agitateur orbital à 37 °C pendant la nuit. Utilisez un kit maxiprep sans endotoxines et extrayez l’ADN plasmidique pur des cultures bactériennes en suivant les instructions du fabricant. Reconstituer l’ADN dans le volume approprié d’eau exempte d’endotoxines pour obtenir une concentration plasmidique de 1 à 2 μg/μL.REMARQUE : Le rendement maxiprep dépend de la croissance de la culture. Habituellement, la remise en suspension de la pastille d’ADN plasmidique dans un volume de 200 μL permet d’obtenir la concentration d’ADN souhaitée. Conservez le tube contenant l’ADN plasmidique à -20 °C jusqu’à utilisation. Préparez un tube de 1,5 mL d’un volume final de 5 μL contenant 2 à 6 μg d’ADN plasmidique destiné à la nucléofection. Préparation du matérielPréparez la solution de nucléofection. Si vous utilisez le kit recommandé (voir le tableau des matériaux), préparez 95 μL de la solution de nucléofection dans un tube de 1,5 mL pour chaque nucléofection désirée. Les pipettes et les cuvettes sont généralement incluses dans le kit. Préparez un exemplaire de chaque pour chaque condition de nucléofection. Préparez une fiole T25 remplie de 4 ml de milieu complet préchauffé par condition et conservez-la dans l’incubateur jusqu’à ce qu’elle soit utilisée. Nucléofection des CSNUtilisez 1 à 2 x 106 cellules individuelles par condition pour l’évaluation. Centrifugez les cellules pendant 5 min à 300 x g, puis retirez le surnageant. Ajouter 1 mL de DPBS et remettre la pastille en suspension en pipetant 10 fois de haut en bas pour assurer une suspension cellulaire homogène. Répéter la centrifugation (étape 2.1.6) pour un deuxième lavage et enfin remettre la pastille en suspension dans 95 μL de solution de nucléofection.REMARQUE : Les étapes de lavage sont cruciales pour éliminer les antibiotiques du milieu de contrôle et assurer une nucléofection efficace. Combinez les 95 μL de cellules avec une solution prémélangée contenant 5 μL de chaque plasmide (2 μg au total) sélectionné pour la nucléofection. À l’aide d’une micropipette P200, transférez cette solution dans une cuvette et placez-la dans le dispositif nucléofecteur. Nucléofect les cellules avec les plasmides souhaités à l’aide du programme NSC optimisé du système nucléofecteur. Une fois l’électroporation terminée, introduisez soigneusement le milieu complet chaud dans la cuvette à l’aide des pipettes Pasteur fournies dans le kit. Ensuite, transférez le contenu de la cuvette dans une fiole T25 préalablement préparée contenant un milieu complet préchauffé. Après l’électroporation, il peut y avoir mort cellulaire, précipitation de l’ADN et formation d’un agrégat visqueux. Évitez de le transférer dans la fiole T25, car cela pourrait réduire la survie cellulaire.REMARQUE : Cette étape est cruciale et doit être effectuée le plus rapidement possible pour assurer un rendement élevé de nucléofection et la survie ultérieure de la culture. Incuber des cellules nucléofectées à 37 °C et 5 % de CO2 dans un incubateur humidifié pendant 3 à 5 jours. Sélection de cellules nucléofectéesStratégie A : Sélection par cytométrie en flux par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS)Après 3 à 5 jours de nucléofection, passer les cultures nucléofectées en suivant l’étape 2.1 et prélever toutes les cellules individualisées obtenues. Filtrez les échantillons à travers une crépine cellulaire de 40 μm pour éliminer les agrégats cellulaires et analysez-les avec le cytomètre en flux du trieur de cellules.REMARQUE : Il est crucial de trier le même nombre de cellules dans chaque condition pour obtenir des résultats comparatifs. À l’aide du logiciel du cytomètre, les cellules vivantes se basent sur deux mesures : la lumière diffusée vers l’avant (FSC-A) qui correspond à la taille de la cellule et la lumière diffusée latérale (SSC-A) qui correspond à la complexité intracellulaire. Sélectionner la population de cellules vivantes caractérisée par un FSC-A élevé et un SSC-A élevé.REMARQUE : Si vous le souhaitez, ajoutez 0,1 μg/mL de 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) à la suspension cellulaire avant le tri. Cela permettra d’éliminer les cellules mortes et les corps apoptotiques du porte. Éliminez les doublets et triplets de cellules en traçant les paramètres FSC-A et FSC-H. Choisissez les événements inclus dans la diagonale du graphique, représentant les maillots.REMARQUE : Lorsque les cellules passent à travers le laser, le cytomètre détecte les changements de tension au fil du temps. FSC-A représente la zone du signal et FSC-H signifie la hauteur de crête. Les singlets présentent une relation proportionnelle entre FSC-A et FSC-H (situés sur la diagonale du graphique), tandis que les agrégats de cellules présentent une FSC-A plus élevée par rapport au FSC-H en raison d’un signal plus long. Sélectionner les cellules nucléofectées en fonction de l’intensité de fluorescence du gène rapporteur codé par le plasmide utilisé. Par exemple, lors de l’utilisation de la GFP+, les cellules peuvent être sélectionnées en fonction des niveaux de fluorescence FITC-A par rapport au tracé SSC-A. Isolez le nombre souhaité de cellules cibles pour chaque condition et collectez-les directement dans un tube de collecte rempli d’un milieu complet. CSN nucléofectées à une densité de 10 000 cellules/cm2. Incuber les cultures cellulaires triées à 37 °C et 5 % de CO2 dans un incubateur humidifié. Stratégie B : Sélection à l’aide de la résistance aux antibiotiques codée dans le plasmideAprès 48 h de nucléofection, ajoutez la concentration d’antibiotiques appropriée pour sélectionner les cellules résistantes.REMARQUE : Avant de commencer, il est recommandé de tester plusieurs concentrations de l’antibiotique sur des cellules non nucléofectées. La concentration optimale d’antibiotiques est la quantité la plus faible à laquelle toutes les cellules non résistantes sont éliminées. Par exemple, nous avons déterminé une concentration optimale de 4 μg/mL d’antibiotique blasticidine pour les cultures de NSC. Incuber les cellules à 37 °C et 5 % de CO2 dans un incubateur humidifié pendant 48 h. Après 48 h de traitement antibiotique, sous-culture des cellules nucléofectées selon l’étape 2.1. Si les neurosphères restent petites, retirer l’antibiotique du milieu de culture par centrifugation à 300 x g pendant 5 min. Remettre les cellules en suspension et les cultiver dans une fiole en utilisant uniquement un milieu complet. Incuber les cellules à 37 °C et 5 % de CO2 dans un incubateur humidifié jusqu’à ce qu’elles puissent être dilatées après l’étape 2.1.