عزل وتوسع ونواة الخلايا الجذعية العصبية من منطقة تحت البطين الفئران البالغة
Özet
هنا ، نصف نظام nucleofection المصمم لتعزيز كفاءة توصيل الجينات في الخلايا الجذعية العصبية الموسعة (NSCs) المعزولة من منطقة تحت البطين للفئران البالغة. تظهر النتائج أن هذه الطريقة تحسن بشكل كبير اضطراب الجينات في NSCs ، متجاوزة فعالية بروتوكولات النقل التقليدية وتعزز معدل بقاء الخلية.
Abstract
يمكن تحقيق عزل وتوسيع الخلايا الجذعية العصبية (NSCs) من المنطقة تحت البطينية (SVZ) لدماغ الفأر البالغ في وسط مكمل بعامل نمو الخلايا الليفية الأساسي (bFGF) وعامل نمو البشرة (EGF) كميتوجين ، مما ينتج عنه مجاميع نسيلية تعرف باسم المجالات العصبية. هذا النظام في المختبر هو أداة قيمة لدراسة إمكانات NSC. يمكن استخدام نقل siRNAs أو الجينات المحمولة في البلازميدات للحث على اضطرابات التعبير الجيني ودراسة بيولوجيا NSC. ومع ذلك ، فإن توصيل الحمض النووي الخارجي إلى مزارع NSC يمثل تحديا بسبب انخفاض كفاءة نقل خلايا الجهاز العصبي المركزي (CNS). هنا ، نقدم نظاما محسنا للنواة يحقق كفاءة عالية في توصيل الجينات في NSCs الموسعة من الفئران البالغة SVZ. لقد أثبتنا أن هذه الطريقة البسيطة نسبيا تعزز اضطراب الجينات في NSCs البالغة ، متجاوزة بروتوكولات النقل التقليدية مع معدلات بقاء تتجاوز 80٪. علاوة على ذلك ، يمكن أيضا تطبيق هذه الطريقة في NSCs الأولية المعزولة ، مما يوفر تقدما حاسما في دراسات وظائف الجينات من خلال التلاعب بالتعبير الجيني عن طريق الضربة القاضية أو الإفراط في التعبير في مزارع الغلاف العصبي.
Introduction
الخلايا الجذعية العصبية (NSCs) هي خلايا جذعية متعددة القدرات مقيمة في الدماغ. تمتلك هذه الخلايا القدرة على التجديد الذاتي والتمايز إلى السلالات العصبية الثلاثة: الخلايا النجمية ، oligodendrocytes ، والخلايا العصبية1. وبالتالي ، تلعب NSCs دورا حاسما في تكوين الخلايا العصبية للبالغين في الثدييات ، وهي عملية يتم فيها إنشاء خلايا عصبية جديدة في الدماغ2. تتواجد NSCs في الغالب في منطقتين داخل الدماغ البالغ تسمى المنافذ العصبية: المنطقة تحت البطينية (SVZ) على طول جدران البطينين الجانبيين والمنطقة تحت الحبيبية (SGZ) داخل التلفيف المسنن للحصين 3,4. NSCs (المعروفة أيضا باسم الخلايا البائية) في SVZ ، وهي أكثر الأماكن العصبية نشاطا في الفأر البالغ ، تجدد ذاتيا وتنتج أسلاف تضخيم العبور (TAPs أو خلايا C) التي تتمايز لاحقا إلى خلايا عصبية (خلايا A). تهاجر هذه الخلايا العصبية عبر تيار الهجرة المنقاري (RMS) إلى المصابيح الشمية (OB) ، حيث تخضع للتمايز الكامل إلى الخلايا العصبية البينية ، وتندمج في الدوائر الموجودة مسبقا3،4،5،6.
إن فهم التفاعل المعقد للإشارات والإشارات الجزيئية التي تنظم NSCs داخل هذه المنافذ أمر مهم لتسخير إمكاناتها للتطبيقات العلاجية. لهذا الغرض ، تم تطوير طرق مختلفة لدراسة هذه الخلايا ، بدءا من الثقافة الأولية الانتقائية ل NSCs إلى اختيار الخلايا باستخدام علامات السطح7،8،9،10. تفصل هذه المخطوطة عزل وزراعة SVZ NSCs في المختبر باستخدام وسط انتقائي خال من المصل يحتوي على كل من الميتوجينات: عامل نمو الخلايا الليفية الأساسي (bFGF) وعامل نمو البشرة (EGF). يسهل هذا الوسط تكاثر الخلايا ويحافظ على جذع NSCs التي تم الحصول عليها من SVZ لأدمغة الفئران البالغة التي تشكل في المختبر مجاميع نسيلية ثلاثية الأبعاد وغير ملتصقة تعرف باسم الكرات العصبية9. تعمل ثقافات الغلاف العصبي كمنصة خاضعة للرقابة لمعالجة ودراسة الآليات والعوامل الجزيئية التي تؤثر على انتشار NSC والتجديد الذاتي والتمايز والبقاء على قيد الحياة11. والجدير بالذكر أن عدد الكرات العصبية الأولية التي تشكلت في الثقافة يسمح بتقدير عدد NSCs الموجودة في SVZ في الجسم الحي ، مما يجعلها أداة قوية لدراسة آثار الظروف المختلفة على تجمع NSC للبالغين12,13. وعلاوة على ذلك، بمجرد إنشاء الثقافة الأولية، يمكن لمراكز الأمن القومي أن تولد مجاميع جديدة (كرات عصبية ثانوية) عند المرور عبر الانقسامات المتماثلة في ظل ظروف الانتشار14. وبالتالي ، يمكن استخدام البذر منخفض الكثافة لخلايا الغلاف العصبي الثانوية (الفحص النسيلي) لتقييم معدل التجديد الذاتي لهذه الثقافات4،15،16،17.
على الرغم من إمكانات المجالات العصبية في الكشف عن الآليات التي تحكم تنظيم NSC ، يشكك بعض الباحثين في صحة النتائج في المختبر ، بحجة أن الظروف الاصطناعية التي تنمو فيها الخلايا قد لا تكرر بأمانة البيئة المكروية المعقدة في الجسم الحي للمنافذ العصبية18،19،20،21،22. نقطة أخرى مثيرة للجدل تدور حول عدم التجانس الملحوظ في المجالات العصبية. ومع ذلك ، يعتقد أن هذا التباين يعكس التقسيمات المتماثلة وغير المتماثلة ل NSCs التي تحدث بشكل طبيعي في الجسم الحي23,24. علاوة على ذلك ، دعم التحقق الأخير استخدام ثقافات NSC للتنبؤ بالآليات التي تعمل داخل مكانة SVZ العصبية في الجسم الحي ، وقد أظهرت العديد من الدراسات أن NSCs المستزرعة في المختبر تحافظ بدقة على ملف النسخ الذي لوحظ في الجسم الحي11،25.
لذلك ، لا تعمل ثقافات الغلاف العصبي كطريقة لاستكشاف قدرات انتشار وتمايز NSC فحسب ، بل تقدم أيضا نظاما لدراسة تأثير الجينات التي تحكم بيولوجيا NSC. تقنية محورية للتحقيق في وظيفة الجينات في NSCs هي اضطراب التعبير الجيني. يمكن نقل siRNAs أو الجينات التي يتم توصيلها من خلال البلازميدات إلى مزارع الخلايا ، مما يؤدي إلى ضربة قاضية أو تنظيم الجين المستهدف. يقلل هذا النهج متعدد الاستخدامات بشكل كبير من الوقت والتكلفة مقارنة بإنشاء مزارع باستخدام الفئران بالضربة القاضية المشروطة ، مما يوفر وسيلة واعدة لكشف الأسس الجينية لتكوين الخلايا العصبية واستكشاف الآفاق العلاجية. إن تغيير التعبير عن جينات معينة في NSCs يمكن من تعديل سلوكها ، مما يؤثر على العمليات البيولوجية الحاسمة مثل الانتشار والتمايز والهجرة. ومع ذلك ، فإن احتمال نقل NSCs ، لا سيما داخل المجالات العصبية للفئران ، يمثل تحديات ملحوظة. إن البنية ثلاثية الأبعاد للكرات العصبية تضر بكفاءة النقل ، مما يؤدي في كثير من الأحيان إلى انخفاض معدلات توصيل الحمض النووي الخارجي الناجح ، مما يحد من مدى التلاعب الجيني26,27. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تؤثر إجراءات النقل بشكل ضار على صلاحية الخلية ووظائفها27. في هذا السياق ، نقدم نظام nucleofection كطريقة للتخفيف من تلف الخلايا ، وتحقيق معدل بقاء مرتفع وضمان فعالية أعلى في فحوصات توصيل الجينات المستخدمة لإزعاج ثقافات NSC.
تهدف هذه المخطوطة إلى توضيح الإجراء الخاص بعزل NSCs وتوسيعها ومعالجتها من مكانة SVZ العصبية البالغة لاضطراب الجينات باستخدام نظام زراعة الغلاف العصبي. تتجاوز هذه الطريقة فعالية بروتوكولات النقل التقليدية ، حيث تقدم معدلات بقاء أعلى بكثير وكفاءة توصيل الجينات المحسنة بين الخلايا المستهدفة.
Protocol
Representative Results
Discussion
نظرا لعدم وجود علامات نهائية لتحديد مجموعة NSC في الجسم الحي ، فقد استند تحليل NSCs في المقام الأول إلى مراقبة سلوك الخلايا المعزولة من المنافذ العصبية في ظروف خارج الجسم الحي . وضع العمل الرائد الذي قام به رينولدز وفايس الأساس من خلال إنشاء ظروف زراعة دقيقة ، مما يتيح عزل وتوسيع الخلايا الفردية من أنسجة SVZ للفأر البالغ من العمر 2 شهرا في ظل ظروف غير لاصقة. عادة ما يتم نشر هذه الخلايا في وسط خال من المصل يحتوي على EGF و bFGF ، وهي ظروف تمنع تماما التمايز إلى الخلايا العصبية والدبقية مع تعزيز الانتشار. في الواقع ، في ظل ظروف الثقافةهذه 9 ، تموت معظم الخلايا خلال الأيام الأولى في الثقافة ، لكن مجموعة فرعية صغيرة تبدأ في الانقسام وتشكل في المقام الأول كرات عصبية عائمة9. يسهل التفكك الأنزيمي والمزارع الفرعية لهذه المجاميع الخلوية انتشار الثقافة ، مما يدل على قدرة التجديد الذاتي لهذه الثقافات.
والجدير بالذكر أن مزارع الغلاف العصبي تظهر إمكانات التوسع مع إضافة EGF فقط ، في حين أن NSCs المزروعة في وسط يحتوي على bFGF فقط لا تظهر تكاثر الخلايا على المدى الطويل30. يشير كلا الدليلين إلى EGF باعتباره الميتوجين الأساسي للتجديد الذاتي ل NSC. ومع ذلك ، فإن وجود كل من EGF و bFGF في وسط الاستزراع يحسن قدرة التجديد الذاتي ل NSCs31 ، وكذلك يساهم في موازنة إمكانات التمايز في الخلايا النجمية والخلايا العصبية والخلايا قليلة التغصن32،33،34،35. علاوة على ذلك ، فإن استخدام مزيج محدد من الهرمونات والعوامل بدلا من البدائل التجارية لتكملة الوسط يضمن الجودة العالية وقابلية التكاثر لثقافات NSC. في ظل هذه الظروف ، يمكن أن تستمر مزارع NSC للفأر كخطوط خلايا مستقرة دون الخضوع للتخليد. ومع ذلك ، فإن مصدر القلق في ثقافات الغلاف العصبي هو إمكانية خضوع مجموعات الخلايا التكاثرية للتحولات الجينية ، وتجاوز الآليات التنظيمية لدورة الخلية وتؤدي إلى نمط ظاهري خالد. لذلك ، على الرغم من أن مزارع الغلاف العصبي قابلة للتوسيع بدرجة كبيرة ، إلا أن الثقافات التي تتجاوز 10 ممرات في المختبر عادة ما يتم تجاهلها للدراسات ، لأنها قد تخضع لشيخوخة متكررة ، وقد تظهر خلايا ذات محتوى كروموسومي غير طبيعي أو ديناميكيات نمو غير منتظمة. علاوة على ذلك ، يجب مراقبة استخدام ثقافات الغلاف العصبي الراسخة على المدى الطويل بشكل مستمر. توفر ثقافات الغلاف العصبي أيضا الفرصة لفحص خصائصها وإمكاناتها في بيئة خاضعة للرقابة ، مما يوفر إعدادا أكثر دقة وقابلية للتعديل يمكن تعديله ومراقبته بدقة أكبر من الجسم الحي. من خلال التحليلات المستنسخة أو السكانية في المختبر ، من الممكن تحديد قدرات التجديد الذاتي والانتشار لهذه الخلايا ، مما يسهل تحديد الآليات الأساسية التي تحكم هذه الخصائص.
ومع ذلك، وعلى الرغم من القائمة الكبيرة من مزايا العمل مع NSCs في المختبر، فإن طبيعة بروتوكول الاستزراع هذا وحساسية NSCs يشكلان تحديا في هذا المجال. على سبيل المثال ، يمكن أن يختلف عدد الكرات العصبية الأولية المتولدة أثناء التشريح النموذجي بشكل كبير بناء على مهارة ودقة المجرب. توضح نتائج الغلاف العصبي الأولي هذا التباين في عدد الكرات العصبية الأولية التي تم الحصول عليها من SVZ للفئران البالغة من العمر شهرين ، والتي تتراوح بين 500 و 3000 كرة عصبية. قد تساهم عوامل مختلفة في هذا التباين. أولا ، تقلل دقة التشريح من الأنسجة المتنية غير المرغوب فيها ، والتي تمنع تكوين المجال الأساسي. ثانيا ، يسمح توليد قطع صغيرة من أنسجة SVZ بالهضم الأنزيمي الفعال والتثليج ، وبالتالي تقليل فقد الخلايا. هذا يسلط الضوء على الحاجة إلى ممارسة مسبقة كافية لبروتوكول التشريح وتطوير دقيق لمعالجة الأنسجة أثناء إنشاء مزارع الغلاف العصبي.
يكمن قيد آخر لهذه الثقافات في حقيقة أن المجالات العصبية يمكن أن تضم كلا من NSCs والخلايا السلفية ، مما يجعل من الصعب التمييز بين هاتين المجموعتين داخل الثقافات الأولية. في حين تم الإبلاغ عن علامات مختلفة مثل GFAP و Nestin و Musashi و SOX2 بواسطةNSCs 8 ، لم يتم ربط أي منها حصريا ب NSCs. مكنت تقنيات FACS الناشئة القائمة على التعبير عن مستضد سطح الخلية من عزل NSCs وذريتها. أظهرت هذه الدراسات أن أسلاف تضخيم العبور غير قادرين على تكوين كرات عصبية عند المرور25،36. وهكذا ، في حين أن العلاقة بين خلايا SVZ والخلايا البادئة للغلاف العصبي تتطلب مزيدا من الصقل18،19،20،21،22،23 ، فإن قدرة الكرات العصبية على المرور بشكل متسلسل على مدى فترة طويلة قد تعكس وجود NSCs في الثقافات.
كان نظام زراعة الغلاف العصبي هذا بمثابة نموذج قوي للتحقيق في تأثير مسارات الإشارات والتعبير الجيني في الحفاظ على قدرة التجديد الذاتي NSC في المختبر15,29. تتضمن إحدى الطرق لاستكشاف هذه الجوانب نقل NSCs إما للإفراط في التعبير عن جينات معينة أو إسقاطها. يمكن تحقيق ذلك من خلال تقنيات مختلفة ، بما في ذلك الطرق الفيروسية وغير الفيروسية. في حين أن النواقل الفيروسية غالبا ما تحقق كفاءة عالية في نقل الجينات ، إلا أن لها قيودا مهمة ، مثل متطلبات السلامة العالية وإنتاج النواقل الذي يستغرق وقتاطويلا 26. على العكس من ذلك ، فإن طرق النقل الكلاسيكية مثل lipofection والتثقيب الكهربائي تحقق معدلات نقل منخفضة للغاية ، مما يجعلها غير مجدية للخلايا التي يصعب نقلها. تقدم تقنية nucleofection نهجا سهل الاستخدام من خلال الجمع بين حلول nucleofection الخاصة بنوع الخلية مع المعلمات الكهربائية الفريدة لكل نوع خلية37,38. هذا يضمن نقل الحمض النووي مباشرة إلى نواة الخلية39 ، مما يسمح بدمج الحمض النووي بطريقة مستقلة عن دورة الخلية. وبالتالي ، يظهر nucleofection كتقنية قابلة للتطبيق لنقل الخلايا التي يصعب نقلها مثل NSCs28,40 للفأر.
أحد قيود هذه الطريقة هو أنه يوصى بما لا يقل عن 2 × 106 خلايا وضروري لكل نواة ، على الرغم من أنه في الظروف المثلى ، يمكن استخدام عدد أقل من الخلايا لكل نواة واحدة (أي 5 × 105 خلايا). عيب آخر لهذه الطريقة هو أن جودة وتركيز الحمض النووي المستخدم في النواة يؤثر بشكل كبير على كفاءة نقل الجينات. يوصى بشدة باستخدام الحمض النووي المحضر الخالي من السموم الداخلية لمنع ارتفاع معدل وفيات الخلايا بسبب وجود السموم الداخلية. بالإضافة إلى ذلك ، فإن استخدام أكثر من 6 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي للنواة يمكن أن يقلل بشكل كبير من كفاءة نقل الجينات وصلاحية الخلية. أخيرا ، يعد إعطاء النبض الكهربائي أمرا بالغ الأهمية أيضا لبقاء الخلايا النووية.
في هذا العمل ، قمنا بتمثيل التلاعب بالتعبير الجيني Snrpn من خلال استخدام استراتيجية تنطوي على تقليل تنظيم تعبيره باستخدام البلازميدات العرضية. لا يتم دمج هذه البلازميدات في جينوم الخلايا ، ومع استمرار NSCs في التكاثر في المختبر ، سيتم تخفيف الحمض النووي الذي تم إدخاله لاحقا على طول انقسام الخلايا ، وبالتالي يفقد تأثير التلاعب الجيني. لذلك ، هذه الاستراتيجية قيمة لدراسة تأثير التغيير الحاد في فترة قصيرة أو لخلايا تاريخ الميلاد في المختبر. تتوفر بعض البدائل لتقييم التأثير المطول للاضطراب الجيني. على سبيل المثال ، يمكن استخدام نظام تكاملي مثل الخنزير القائم على الترانسبوزونBAC. يتكون هذا النظام من إدخال تسلسل الترميز المطلوب الموجود في البلازميد المحاط بتسلسلات قابلة للنقل ومشاركة الخلايا في النواة ببلازميد يحتوي على تسلسل إنزيم transposase41. وبدلا من ذلك، يمكن استخدام الترانسبوزونات أو أنظمة كريسبر/كاس.
سيكون التطوير الإضافي لتقنيات النقل خطوة مهمة نحو فحوصات عالية الإنتاجية لتقييم دور الجينات المختلفة في فسيولوجيا الخلايا الجذعية العصبية للبالغين. بالاقتران مع طرق التنقية والتوسع المتطورة بشكل متزايد ، ستمكن هذه الدراسات من فهم البيولوجيا في المختبر ل NSCs البالغة ومقارنة الاختلافات البيولوجية بين المجالات العصبية العائمة و NSCs في الجسم الحي.
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل بمنح من وزارة العلوم والابتكار والوكالة الحكومية للبحوث (MCIN/AEI) (PID2019-110045GB-I00; PID2022-142734OB-I00 و EUR2023-143479) إلى SRF. يتم تمويل EJV (FPU20 / 00795) و DSL (FPU22 / 03797) من قبل برنامج زمالة Formación de Profesorado Universitario الإسباني (FPU). يتم تمويل LLC (PRE2020-094137) و JDM (PREP2022-000680) من قبل برنامج زمالة Formación de Personal Investigador الإسباني (FPI). يتم تمويل CMM (CIACIF / 2022/366) من قبل Generalitat Valenciana. يتم تمويل MIL (CPI-22-481) من قبل زمالة Programa INVESTIGO (الجيل القادم من الاتحاد الأوروبي). تمويل الوصول المفتوح المقدم من وزارة العلوم والابتكار.
Materials
| 0.22 μm pore-filter bottles (250 mL) | VWR | 514-0330P | |
| 0.22 μm pore-filter bottles (500 mL) | VWR | 514-0332P | |
| 12-well plate | LabClinics | PLC30012 | |
| 15 mL tube | Fisher | 10738771 | |
| 24-well plate | LabClinics | PLC30024 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | BioWest | L0180-100 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma | D9542 | |
| 48-well plate | ThermoFisher | 150687 | |
| 6-well plate | LabClinics | PLC30006 | |
| 96-well plate | Labclinics | PLC30096 | |
| Accutase solution | Sigma | A6964-100ML | Referred as enzymatic solution |
| Amaxa Mouse Neural Stem Cell Nucleofector Kit | Lonza | VPG-1004 | |
| Amaxa Nucleofector Iib | Lonza | 10700807 | |
| Antibiotic/Antimitotic (A/A) | Sigma | A5955 | |
| Apo-t-Transferrine | Sigma | T2252-1G | |
| Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | Sigma | F0291 | |
| Blasticidin | Sigma | 203350 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | B4287-25MG | |
| Cell strainer 40 μm | LabClinics | PLC93040 | |
| Deoxynucleotide triphosphate (dNTPs) | NZYTech | MB08701 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | |
| Dulbecco’s Phosphate Saline Buffer (DPBS) | Gibco | 14080-055 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) F12 1:1 | Gibco | 11320-074 | |
| E. coli DH5α Competent Cells | ThermoFisher | EC0112 | |
| Earles's Balanced Salt Solution (EBSS) | Gibco | 24010-043 | |
| Epidermal Growth Factor – Human recombinant (EGF) | Gibco | 53003-018 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | E-6511 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11274-20 | |
| Fine Scissors Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Glucose | Sigma | G-7021 | |
| GoTaq G2 Flexi DNA Polymerase | Promega | M7805 | Kit includes reagents for PCR |
| Heparin | Sigma | H-3149 | |
| Insuline | Sigma | I6634 | |
| LB agar (Lennox) | LabKem | AGLB-00P-500 | |
| LB broth (Lennox) | LabKem | LBBR-00P-500 | |
| L-Cysteine | Sigma | C-8277 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-024 | |
| Neubauer chamber | Blaubrand | BR718620 | |
| Nuclease free water | Labbox | WATR-00A-10K | |
| NZYMaxiprep Endotoxin Free Kit | NZYTech | MB39901 | |
| Papain Lyophilized | Worthington | LS003119 | |
| Progesterone | Sigma | P-6149 | |
| Putrescine | Sigma | P-7505 | |
| Scalpel | Fine Science Tools | 10316-14 | |
| shSCRAMBLE | Mission (Sigma) | SHC003 | |
| shSNRPN | Mission (Sigma) | TRCN0000109285 | |
| Sodium Selenite | Sigma | S-9133 | |
| Spatula | Fine Science Tools | 10090-17 | |
| Sterile PES Syringe Filters (0.22 μm pore-filter) | Epica | SFPE-22E-050 | |
| T12.5 cm2 Flask | Biofil | TCF012025 | |
| T25 cm2 Flask | LabClinics | PLC70025 | |
| T75 cm2 Flask | LabClinics | PLC70075 | |
| Tweezers | Fine Science Tools | 91150-20 |
Referanslar
- Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287 (5457), 1433-1438 (2000).
- Ming, G., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian central nervous system. Ann Rev Neurosci. 28 (1), 223-250 (2005).
- Doetsch, F., Caillé, I., Lim, D. A., García-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Subventricular zone astrocytes are neural stem cells in the adult mammalian brain. Cell. 97 (6), 703-716 (1999).
- Obernier, K., et al. Adult neurogenesis is sustained by symmetric self-renewal and differentiation. Cell Stem Cell. 22 (2), 221-234 (2018).
- Doetsch, F., García-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Regeneration of a germinal layer in the adult mammalian brain. Proc Natl Acad Sci. 96 (20), 11619-11624 (1999).
- Doetsch, F., García-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Cellular composition and three-dimensional organization of the subventricular germinal zone in the adult mammalian brain. J Neurosci. 17 (13), 5046-5061 (1997).
- Mamber, C., Kozareva, D. A., Kamphuis, W., Hol, E. M. Shades of gray: The delineation of marker expression within the adult rodent subventricular zone. Prog Neurobiol. 111, 1-16 (2013).
- Cebrian-Silla, A., et al. Single-cell analysis of the ventricular-subventricular zone reveals signatures of dorsal and ventral adult neurogenesis. eLife. 10, e67436 (2021).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. J Vis Exp. (45), e2393 (2010).
- Jensen, J. B., Parmar, M. Strengths and limitations of the neurosphere culture system. Mol Neurobiol. 34 (3), 153-161 (2006).
- Ferrón, S. R., et al. Postnatal loss of Dlk1 imprinting in stem cells and niche astrocytes regulates neurogenesis. Nature. 475 (7356), 381-385 (2011).
- Gil-Perotín, S., et al. Adult neural stem cells from the subventricular zone: A review of the neurosphere assay. Anat Record. 296 (9), 1435-1452 (2013).
- Obernier, K., Alvarez-Buylla, A. Neural stem cells: origin, heterogeneity and regulation in the adult mammalian brain. Development. 146 (4), 156059 (2019).
- Ferrón, S. R., et al. A combined ex/in vivo assay to detect effects of exogenously added factors in neural stem cells. Nat Prot. 2 (4), 849-859 (2007).
- Ferron, S., et al. Telomere shortening and chromosomal instability abrogates proliferation of adult but not embryonic neural stem cells. Development. 131 (16), 4059-4070 (2004).
- Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nat Meth. 3 (10), 801-806 (2006).
- Santa-Olalla, J., Baizabal, J., Fregoso, M., Cárdenas, M. D. C., Covarrubias, L. The in vivo positional identity gene expression code is not preserved in neural stem cells grown in culture. Eur J Neurosci. 18 (5), 1073-1084 (2003).
- Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. Eyes wide open: A critical review of sphere-formation as an assay for stem cells. Cell Stem Cell. 8 (5), 486-498 (2011).
- Wan, F., et al. The utility and limitations of neurosphere assay, CD133 immunophenotyping and side population assay in Glioma stem cell research. Brain Pathol. 20 (5), 877-889 (2010).
- Deleyrolle, L. P., Rietze, R. L., Reynolds, B. A. The neurosphere assay, a method under scrutiny. Acta Neuropsych. 20 (1), 2-8 (2008).
- Campos, L. S. Neurospheres: Insights into neural stem cell biology. Neurosci Res. 78 (6), 761-769 (2004).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres—re-evaluating the relationship. Nat Meth. 2 (5), 333-336 (2005).
- Parker, M. A. Expression profile of an operationally-defined neural stem cell clone. Exp Neurol. 194 (2), 320-332 (2005).
- Belenguer, G., et al. Adult neural stem cells are alerted by systemic inflammation through TNF-α receptor signaling. Cell Stem Cell. 28 (2), 285-299 (2021).
- Cruz, M. T. G., Simões, S., Lima, M. C. P. de Improving lipoplex-mediated gene transfer into C6 glioma cells and primary neurons. Exp Neurol. 187 (1), 65-75 (2004).
- Hagemann, C., et al. High efficiency transfection of glioma cell lines and primary cells for overexpression and RNAi experiments. J Neurosci Meth. 156 (12), 194-202 (2006).
- Moritz, S., Lehmann, S., Faissner, A., Holst, A. von An induction gene trap screen in neural stem cells reveals an instructive function of the niche and identifies the splicing regulator Sam68 as a Tenascin-C-regulated target gene. Stem Cells. 26 (9), 2321-2331 (2008).
- Montalbán-Loro, R., et al. TET3 prevents terminal differentiation of adult NSCs by a non-catalytic action at Snrpn. Nat Comm. 10 (1), 1726 (2019).
- Gritti, A., et al. Epidermal and fibroblast growth factors behave as mitogenic regulators for a single multipotent stem cell-like population from the subventricular region of the adult mouse forebrain. J Neurosci. 19 (9), 3287-3297 (1999).
- Nieto-Estévez, V., Pignatelli, J., Araúzo-Bravo, M. J., Hurtado-Chong, A., Vicario-Abejón, C. A global transcriptome analysis reveals molecular hallmarks of neural stem cell death, survival, and differentiation in response to partial FGF-2 and EGF deprivation. PLoS One. 8 (1), 53594 (2013).
- Vergaño-Vera, E., Méndez-Gómez, H. R., Hurtado-Chong, A., Cigudosa, J. C., Vicario-Abejón, C. Fibroblast growth factor-2 increases the expression of neurogenic genes and promotes the migration and differentiation of neurons derived from transplanted neural stem/progenitor cells. Nörobilim. 162 (1), 39-54 (2009).
- Gabay, L., Lowell, S., Rubin, L. L., Anderson, D. J. Deregulation of dorsoventral patterning by FGF confers trilineage differentiation capacity on CNS stem cells in vitro. Neuron. 40 (3), 485-499 (2003).
- Hack, M. A., Sugimori, M., Lundberg, C., Nakafuku, M., Götz, M. Regionalization and fate specification in neurospheres: the role of Olig2 and Pax6. Mol Cell Neurosci. 25 (4), 664-678 (2004).
- Bithell, A., Finch, S. E., Hornby, M. F., Williams, B. P. Fibroblast growth factor 2 maintains the neurogenic capacity of embryonic neural progenitor cells in vitro but changes their neuronal subtype specification. Stem Cells. 26 (6), 1565-1574 (2008).
- Pastrana, E., Cheng, L. C., Doetsch, F. Simultaneous prospective purification of adult subventricular zone neural stem cells and their progeny. Proc Natl Acad Sci. 106 (15), 6387-6392 (2009).
- Kobayashi, N., et al. Gene delivery to embryonic stem cells. Birth Def Res C. 75 (1), 10-18 (2005).
- Gresch, O., Altrogge, L. Transfection of difficult-to-transfect primary mammalian cells. Meth Mol Biol. 801, 65-74 (2011).
- Maasho, K., Marusina, A., Reynolds, N. M., Coligan, J. E., Borrego, F. Efficient gene transfer into the human natural killer cell line, NKL, using the Amaxa nucleofection system. J Immunol Meth. 284 (1-2), 133-140 (2004).
- von Holst, A., Egbers, U., Prochiantz, A., Faissner, A. Neural stem/progenitor cells express 20 tenascin C isoforms that are differentially regulated by Pax6. J Biol Chem. 282 (12), 9172-9181 (2007).
- Woodard, L. E., Wilson, M. H. piggyBac-ing models and new therapeutic strategies. Trend Biotechnol. 33 (9), 525-533 (2015).
