Ensaio de migração in vitro em tempo real para células T CD8+ murinas primárias
Özet
Este protocolo fornece um método de isolamento primário de células T murinas e microscopia de lapso de tempo da migração de células T sob condições ambientais específicas com análise quantitativa.
Abstract
A resposta imune adaptativa depende da capacidade de uma célula T de migrar através do sangue, linfa e tecido em resposta a patógenos e corpos estranhos. A migração de células T é um processo complexo que requer a coordenação de muitas entradas de sinal do ambiente e das células imunes locais, incluindo quimiocinas, receptores de quimiocinas e moléculas de adesão. Além disso, a motilidade das células T é influenciada por pistas ambientais dinâmicas circundantes, que podem alterar o estado de ativação, a paisagem transcricional, a expressão da molécula de adesão e muito mais. In vivo, a complexidade desses fatores aparentemente entrelaçados torna difícil distinguir sinais individuais que contribuem para a migração de células T. Este protocolo fornece uma série de métodos, desde o isolamento de células T até a análise auxiliada por computador para avaliar a migração de células T em tempo real sob condições ambientais altamente específicas. Essas condições podem ajudar a elucidar os mecanismos que regulam a migração, melhorando nossa compreensão da cinética das células T e fornecendo fortes evidências mecanicistas que são difíceis de obter por meio de experimentos com animais. Uma compreensão mais profunda das interações moleculares que afetam a migração celular é importante para desenvolver uma terapêutica aprimorada.
Introduction
As células T são os principais efetores da resposta imune adaptativa e específica do antígeno. Em nível populacional, as células T são heterogêneas, compostas por subconjuntos celulares com funções especializadas distintas. É importante ressaltar que as células T CD8+ são os principais efetores citolíticos do sistema imunológico, que eliminam diretamente as células infectadas ou disfuncionais1.
As células T CD8+ maduras residem no tecido e circulam pelo sangue e linfáticos em busca de antígenos. Durante a infecção, as células T são apresentadas a antígenos no sangue ou tecido e drenam rapidamente para o baço ou linfonodo de drenagem mais próximo para iniciar uma resposta imune produtiva. Em ambos os casos, as células T são ativadas, sofrem expansão clonal e deixam o sistema linfático para entrar no sangue, se ainda não estiverem lá. Durante esse processo, a sinalização intracelular confere a regulação negativa dos receptores linfáticos e a regulação positiva de vários receptores de integrina e quimiocina essenciais para a migração específica do tecido2. Em última análise, a migração direcionada de células T para locais de infecção é impulsionada por sinais ambientais convergentes que incluem sinalização de integrina e quimiocina.
As quimiocinas podem ser amplamente categorizadas em duas classes principais: (1) sinais homeostáticos, que são essenciais para diferenciação, sobrevivência e função basal, e (2) sinais inflamatórios, como CXCL9, CXCL10 e CCL3, que são necessários para a quimiotaxia. Geralmente, as quimiocinas criam um gradiente de sinal que impulsiona a migração direcional, conhecida como quimiotaxia, além de ativar a expressão da integrina1. A quimiotaxia é finamente regulada e altamente sensível, com células T capazes de responder a pequenas mudanças no gradiente que podem levá-las a uma direção ou local específico.
Além desses fatores relacionados às células T, a migração também é afetada pela composição e densidade da matriz extracelular (MEC). A ECM é composta por uma densa rede de proteínas, incluindo colágeno e proteoglicanos, que fornecem a estrutura para receptores de integrina adesiva nas células T. As integrinas são uma família diversificada de proteínas transmembranares, cada uma com domínios de ligação altamente especializados e efeitos de sinalização a jusante. A expressão dinâmica dos receptores de integrina na superfície de uma célula T permite uma rápida adaptação aos seus ambientes em mudança3. É importante ressaltar que as integrinas conectam as redes de ACTINA do citoesqueleto intracelular e do citoesqueleto intracelular que trabalham juntas para gerar a força propulsora necessária para o movimento das células T.
Em resumo, os padrões de migração variam de acordo com o fenótipo da célula imune ou sinais ambientais. Esses processos biológicos complexos são rigidamente regulados pela expressão de citocinas, quimiocinas e integrinas na superfície da célula T, nas células circundantes e no tecido infectado local. In vivo, esses mecanismos migratórios podem ser complexos e podem resultar de vários sinais aditivos4. Devido a essa complexidade, pode ser impossível estabelecer uma relação causal entre variáveis aparentemente interligadas. Para superar isso, existem várias abordagens in vitro para estudar aspectos específicos da migração de células T, como resposta a sinais específicos de quimiocinas e a interação entre integrinas de células T e proteínas de ligação à MEC. Este protocolo aborda métodos para isolar e ativar células T CD8+ murinas, com ensaios de migração in vitro no espaço bidimensional e ferramentas de análise computacional para análise da migração de células T especificadas. Esses métodos são vantajosos para o usuário porque não requerem materiais ou dispositivos sofisticados, como acontece com alguns outros ensaios de migração celular descritos na literatura. Os dados de migração celular gerados com esses métodos podem fornecer evidências de respostas imunes de maneira simplista que permite uma investigação mais aprofundada e informada in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Compreender o impacto biológico dos sinais convergentes in vivo é desafiador e não é fácil de interpretar. Os protocolos aqui apresentados fornecem um método razoável para entender a migração de células T em condições altamente definidas e biologicamente relevantes. Essas condições podem ser especificadas com base no critério do investigador, e os protocolos podem ser modificados para atender às necessidades de várias populações de células T, status de ativação e fenótipo celular. Além di…
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos aos membros anteriores e atuais do Kim Lab que contribuíram para o desenvolvimento desses protocolos ao longo do tempo. Dados representativos foram possibilitados por P01 AI102851/AI/NIAID NIH HHS/Estados Unidos e P01 HL018208/HL/NHLBI NIH HHS/Estados Unidos. Esta publicação foi possível em parte pelo número de concessão T32 GM135134 do Prêmio Institucional Ruth L. Kirschstein National Research Service.
Materials
| 10 cm dish | Corning | 353003 | or equivalent |
| 15 mL conical tube | ThermoFisher | 339650 | or equivalent |
| 1x DPBS | Gibco | 14190144 | without calcium and without magnesium |
| 6 well plate non-TC treated | Corning | 3736 | or equivalent |
| 70 µm cell strainer | FisherScientific | 352350 | or equivalent |
| ACK lysing buffer | ThermoFisher | A1049201 | or equivalent |
| Allegra 6KR centrifuge | ThermoScientific | sorvall 16R with tx400 3655 rotor and bucket | or equivalent |
| Beta mercaptoethanol | Sigma | M3148 | or equivalent |
| CellTrace Violet | ThermoFisher | C34571 | Or equivalent |
| Centrifuge | ThermoScientific | Sorvall ST 16R | or equivalent |
| Collagen (IV) | Corning | 354233 | or equivalent |
| DeltaT culture dish .17 mm thick glass clear | Bioptechs | 04200417C | |
| Dynabeads Sheep anti-Rat IgG | Invitrogen | 11035 | |
| DynaMag 15 Magnet | ThermoFisher Scientific | 12301D | or equivalent |
| Easy sep mouse T cell isolation kit | Stem Cell | 19851 | |
| FBS | SigmaAldrich | F2442-500ML | or equivalent |
| Fibronectin | SigmaAldrich | 10838039001 | or equivalent |
| Fiji | http://fiji.sc/ | weblink | |
| Filter cubes | Nikon or Olympus | ||
| GK1.5 | ATCC | TIB-207 | |
| HEPES | ThermoFisher | 15630080 | or equivalent |
| HQ CCD camera | CoolSNAP | or equivalent | |
| ImageJ | http://imagej.nih.gov/ij/h | weblink | |
| ImageJ automatic tracking plug in | http://imagej.net/TrackMate | weblink | |
| ImageJ manual tracking plug in | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html | weblink | |
| L-15 | Various | See Materials | Medium Recipe: Leibovitz’s L-15 medium without phenol red (Gibco) supplemented with 1-5 g/L glucose |
| Liebovitz's L-15 medium, no phenol red | ThermoFisher | 21083027 | |
| Luer Lok disposable syringe | Fisher Scientific | 14-955-459 | or equivalent |
| Lymphocyte separation medium | Corning | 25-072-CI | or equivalent |
| M5/114 | ATCC | TIB-120 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | ThermoFisher | 11140050 | or equivalent |
| Microscope heating system | Okolab | okolab.com | Custom designs available |
| Millicell EZ slide | Millipore | C86024 | |
| Mojosort mouse CD8+ Naïve T cell isolation kit | Biolegend | 480043 | |
| Mouse E-cadherin | R&D systems | 8875-EC-050 | or equivalent |
| Mouse surgical dissection kit | Fisher Scientific | 13-820-096 | or equivalent |
| NIS elements | Nikon | Software | |
| non-TC 24wp | Corning | 353047 | or equivalent |
| Penicillin-streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | or equivalent |
| Protein A | ThermoFisher Scientific | or equivalent | |
| R9 | Various | See Materials | Medium Recipe: RPMI 1640x supplemented with 10 % FBS, 1 % antibiotic-antimycotic (Gibco), 20 mM HEPES buffer (Gibco), 1 % MEM Non-Essential Amino Acids (Gibco), 50 μM β-mercaptoethanol (Sigma-Aldrich) |
| Recombinant mouse ICAM-1 Fc chimera | R&D systems | 796-IC-050 | or equivalent |
| Recombinant Mouse IL2 | Biolegend | 575410 | or equivalent |
| RPMI 1640x | ThermoFisher | 11875093 | or equivalent |
| T pins | Fisher Scientific | S99385 | or equivalent |
| TE2000-U microscope | Nikon | or equivalent | |
| Various recombinant mouse chemokine | R&D systems | or equivalent | |
| VCAM-1 Fc chimera | R&D systems | 643-VM-050 | or equivalent |
| Volocity | PerkinElmer | Software |
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