Özet

일차 쥐 CD8+ T 세포에 대한 Real-Time In Vitro Migration Assay

Published: May 24, 2024
doi:

Özet

이 프로토콜은 정량 분석을 통해 특정 환경 조건에서 T 세포 이동의 일차 쥐 T 세포 분리 및 타임 랩스 현미경 검사 방법을 제공합니다.

Abstract

적응 면역 반응은 병원체와 이물질에 반응하여 혈액, 림프 및 조직을 통해 이동하는 T 세포의 능력에 의존합니다. T 세포 이동은 케모카인, 케모카인 수용체 및 접착 분자를 포함한 환경 및 국소 면역 세포의 많은 신호 입력의 조정이 필요한 복잡한 과정입니다. 또한 T 세포 운동성은 활성화 상태, 전사 환경, 접착 분자 발현 등을 변경할 수 있는 동적 주변 환경 단서의 영향을 받습니다. 생체 내에서는 겉으로 보기에 서로 얽혀 있는 것처럼 보이는 요인들의 복잡성으로 인해 T 세포 이동에 기여하는 개별 신호를 구별하기 어렵습니다. 이 프로토콜은 매우 특정한 환경 조건에서 실시간으로 T 세포 이동을 평가하기 위해 T 세포 분리에서 컴퓨터 지원 분석에 이르기까지 일련의 방법을 제공합니다. 이러한 조건은 이동을 조절하는 메커니즘을 규명하고, T 세포 동역학에 대한 이해를 높이고, 동물 실험을 통해 얻기 어려운 강력한 기계론적 증거를 제공하는 데 도움이 될 수 있습니다. 세포 이동에 영향을 미치는 분자 상호 작용에 대한 심층적인 이해는 개선된 치료법을 개발하는 데 중요합니다.

Introduction

T 세포는 적응형 항원 특이적 면역 반응의 주요 효과인자입니다. 집단 수준에서 T 세포는 이질적이며, 뚜렷한 특수 기능을 가진 세포 하위 집합으로 구성됩니다. 중요한 것은 CD8+ T 세포가 면역 체계의 주요 세포 용해 효과인자로, 감염되거나 기능 장애가 있는 세포를 직접 제거한다는 것입니다1.

성숙한 CD8+ T 세포는 조직에 상주하며 항원을 찾기 위해 혈액과 림프관을 순환합니다. 감염 중에는 T 세포에 혈액이나 조직에 항원이 제시되고 비장이나 가장 가까운 배수 림프절로 빠르게 배출되어 생산적인 면역 반응을 시작합니다. 어느 경우에나, T 세포는 활성화되고, 클론 확장을 겪으며, 림프계가 혈액 속으로 들어가도록 내버려 둔다. 이 과정에서 세포내 신호전달은 림프 귀환 수용체(lymphatic homing receptor)의 하향 조절과 조직 특이적 이동에 필수적인 수많은 인테그린 수용체(integrin receptor)와 케모카인 수용체(chemokine receptor)의 상향 조절을 부여한다2. 궁극적으로, T 세포가 감염 부위로 직접 이동하는 것은 인테그린(integrin)과 케모카인(chemokine) 신호전달을 포함하는 환경적 신호의 수렴에 의해 주도됩니다.

케모카인은 크게 두 가지로 분류할 수 있습니다: (1) 분화, 생존 및 기초 기능에 필수적인 항상성 신호와 (2) 화학주성에 필요한 CXCL9, CXCL10, CCL3와 같은 염증 신호. 일반적으로 케모카인은 인테그린 발현1을 활성화하는 것 외에도 화학주성(chemotaxis)으로 알려진 방향성 이동을 촉진하는 신호 구배를 생성합니다. 화학주성은 미세하게 조절되고 매우 민감하며, T 세포는 특정 방향이나 위치로 유도할 수 있는 구배의 작은 변화에 반응할 수 있습니다.

이러한 T 세포 관련 요인 외에도 이동은 세포외 기질(ECM) 조성 및 밀도에 의해서도 영향을 받습니다. ECM은 콜라겐과 프로테오글리칸을 포함한 단백질의 조밀한 네트워크로 구성되어 있으며, 이들은 T 세포의 접착 인테그린 수용체에 대한 골격을 제공합니다. 인테그린(Integrins)은 다양한 막관통 단백질군으로, 각 단백질은 고도로 전문화된 결합 도메인과 다운스트림 신호 효과를 가지고 있습니다. T 세포 표면에서 인테그린 수용체의 동적 발현은 변화하는 환경에 빠르게 적응할 수 있도록 합니다3. 중요한 것은 인테그린이 ECM과 세포 내 세포골격 액틴 네트워크를 연결하여 T 세포 이동에 필요한 추진력을 생성한다는 것입니다.

요약하면, 이동 패턴은 면역 세포 표현형 또는 환경 신호에 따라 달라집니다. 이러한 복잡한 생물학적 과정은 T 세포, 주변 세포 및 국소적으로 감염된 조직의 표면에서 사이토카인, 케모카인 및 인테그린의 발현에 의해 엄격하게 조절됩니다. 생체 내에서, 이러한 이동 메커니즘은 복잡할 수 있으며, 여러 가지 부가적 신호(additive signal)4에 의해 발생할 수 있다. 이러한 복잡성으로 인해 겉보기에 서로 맞물려 있는 것처럼 보이는 변수 간의 인과 관계를 설정하는 것이 불가능할 수 있습니다. 이를 극복하기 위해 특정 케모카인 신호에 대한 반응 및 T 세포 인테그린과 ECM 결합 단백질 간의 상호 작용과 같은 T 세포 이동의 특정 측면을 연구하기 위한 몇 가지 시험관 내 접근 방식이 있습니다. 이 프로토콜은 2차원 공간에서의 체외 이동 분석과 지정된 T 세포 이동을 분석하기 위한 계산 분석 도구를 사용하여 쥐 CD8+ T 세포를 분리하고 활성화하는 방법을 다룹니다. 이러한 방법은 문헌에 기술된 일부 다른 세포 이동 분석법과 같이 정교한 재료나 장치를 필요로 하지 않기 때문에 사용자에게 유리합니다. 이러한 방법으로 생성된 세포 이동 데이터는 생체 내에서 정보에 입각한 추가 조사를 가능하게 하는 단순한 방식으로 면역 반응의 증거를 제공할 수 있습니다.

Protocol

동물 프로토콜은 로체스터 대학의 동물 자원에 관한 대학 위원회의 승인을 받았습니다. 이 연구의 마우스는 로체스터 대학 동물 시설의 병원체가 없는 공간에서 유지되었습니다. 본 연구에는 6-12주(15-30g)의 수컷/암컷 C57BL/6마리 마우스가 사용되었습니다. 마우스 조직 분리는 손을 가리는 장갑과 코와 입을 가리는 안면 마스크가 있는 벤치탑 또는 생물 안전 캐비닛 내부에서 수행할 수 있습니다. ?…

Representative Results

T 세포 활성화의 확인은 유세포 분석을 통해 달성할 수 있으며, 쥐 T 세포에서 활성화의 표준 마커인 CD69 및 CD44의 발현 증가를 확인할 수 있습니다6. 또한 T 세포 집단의 순도는 CD3+ CD8+ T 세포에 대한 유세포 분석으로 측정할 수 있습니다. 이 방법은 >90 % CD8+ T 세포 집단을 생성합니다. T 세포 이동은 연구자의 요구에 맞게 재현 가능하고…

Discussion

생체 내 수렴 신호의 생물학적 영향을 이해하는 것은 어렵고 해석하기도 쉽지 않습니다. 본 명세서에 제시된 프로토콜은 고도로 정의되고 생물학적으로 유의미한 조건에서의 T 세포 이동을 이해하기 위한 합리적인 방법을 제공한다. 이러한 조건은 연구자의 재량에 따라 지정할 수 있으며 다양한 T 세포 집단, 활성화 상태 및 세포 표현형의 요구에 맞게 프로토콜을 수정할 수 있습니다. 또한…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는 시간이 지남에 따라 이러한 프로토콜의 개발에 기여한 Kim Lab의 이전 및 현재 구성원에게 감사드립니다. 대표 데이터는 P01 AI102851/AI/NIAID NIH HHS/United States 및 P01 HL018208/HL/NHLBI NIH HHS/United States에 의해 가능했습니다. 이 간행물은 Institutional Ruth L. Kirschstein National Research Service Award의 보조금 번호 T32 GM135134 덕분에 부분적으로 가능했습니다.

Materials

10 cm dish Corning 353003 or equivalent
15 mL conical tube ThermoFisher 339650 or equivalent
1x DPBS Gibco 14190144 without calcium and without magnesium
6 well plate non-TC treated Corning 3736 or equivalent
70 µm cell strainer FisherScientific 352350 or equivalent
ACK lysing buffer ThermoFisher A1049201 or equivalent
Allegra 6KR centrifuge ThermoScientific sorvall 16R with tx400 3655 rotor and bucket or equivalent
Beta mercaptoethanol Sigma M3148 or equivalent
CellTrace Violet ThermoFisher C34571 Or equivalent
Centrifuge ThermoScientific Sorvall ST 16R or equivalent
Collagen (IV) Corning 354233 or equivalent
DeltaT culture dish .17 mm thick glass clear Bioptechs 04200417C
Dynabeads Sheep anti-Rat IgG Invitrogen 11035
DynaMag 15 Magnet ThermoFisher Scientific 12301D or equivalent
Easy sep mouse T cell isolation kit Stem Cell 19851
FBS SigmaAldrich F2442-500ML or equivalent
Fibronectin SigmaAldrich 10838039001 or equivalent
Fiji http://fiji.sc/ weblink
Filter cubes Nikon or Olympus
GK1.5 ATCC TIB-207
HEPES ThermoFisher 15630080 or equivalent
HQ CCD camera CoolSNAP or equivalent
ImageJ http://imagej.nih.gov/ij/h weblink
ImageJ automatic tracking plug in http://imagej.net/TrackMate weblink
ImageJ manual tracking plug in https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html weblink
L-15 Various See Materials Medium Recipe: Leibovitz’s L-15 medium without phenol red (Gibco) supplemented with 1-5 g/L glucose
Liebovitz's L-15 medium, no phenol red ThermoFisher 21083027
Luer Lok disposable syringe Fisher Scientific 14-955-459 or equivalent
Lymphocyte separation medium Corning 25-072-CI or equivalent
M5/114 ATCC TIB-120
MEM Non-Essential Amino Acids ThermoFisher 11140050 or equivalent
Microscope heating system Okolab okolab.com Custom designs available
Millicell EZ slide Millipore C86024
Mojosort mouse CD8+ Naïve T cell isolation kit Biolegend 480043
Mouse E-cadherin R&D systems 8875-EC-050 or equivalent
Mouse surgical dissection kit Fisher Scientific 13-820-096 or equivalent
NIS elements Nikon Software
non-TC 24wp Corning 353047 or equivalent
Penicillin-streptomycin ThermoFisher 15140122 or equivalent
Protein A ThermoFisher Scientific or equivalent
R9 Various See Materials Medium Recipe: RPMI 1640x supplemented with 10 % FBS, 1 % antibiotic-antimycotic (Gibco), 20 mM HEPES buffer (Gibco), 1 % MEM Non-Essential Amino Acids (Gibco), 50 μM β-mercaptoethanol (Sigma-Aldrich)
Recombinant mouse ICAM-1 Fc chimera R&D systems 796-IC-050 or equivalent
Recombinant Mouse IL2 Biolegend 575410 or equivalent
RPMI 1640x ThermoFisher 11875093 or equivalent
T pins Fisher Scientific S99385 or equivalent
TE2000-U microscope Nikon or equivalent
Various recombinant mouse chemokine R&D systems or equivalent
VCAM-1 Fc chimera R&D systems 643-VM-050 or equivalent
Volocity PerkinElmer Software

Referanslar

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Ryan, A. T., Dahal, A., Mir, S., Kim, M., Lim, K. Real-Time In Vitro Migration Assay for Primary Murine CD8+ T Cells. J. Vis. Exp. (207), e66580, doi:10.3791/66580 (2024).

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