Separação Rápida e Exibição de Agentes Fibrinogenolíticos Ativos em Sipunculus nudus por meio de Eletroforese em Gel de Fibrinogênio-Poliacrilamida
Özet
Aqui, apresentamos um protocolo de eletroforese em gel de fibrinogênio-poliacrilamida (PAGE) para separar e exibir rapidamente os agentes fibrinogenolíticos de Sipunculus nudus.
Abstract
Agentes fibrinogenolíticos que podem dissolver o fibrinogênio diretamente têm sido amplamente utilizados no tratamento anticoagulante. Geralmente, a identificação de novos agentes fibrinogenolíticos requer a separação de cada componente primeiro e, em seguida, a verificação de suas atividades fibrinogenolíticas. Atualmente, a eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) e a cromatografia são usadas principalmente na etapa de separação. Enquanto isso, o ensaio em placa de fibrinogênio e produtos de reação baseados em PAGE são geralmente adotados para exibir suas atividades fibrinogenolíticas. No entanto, devido à separação espaço-temporal desses dois estágios, é impossível separar e exibir os agentes fibrinogenolíticos ativos com o mesmo gel. Para simplificar os processos de separação e exibição da identificação do agente fibrinogenolítico, construímos um novo método fibrinogênio-PAGE para separar e exibir rapidamente os agentes fibrinogenolíticos de vermes do amendoim (Sipunculus nudus) neste estudo. Este método inclui preparação de fibrinogênio-PAGE, eletroforese, renaturação, incubação, coloração e descoloração. A atividade fibrinogenolítica e o peso molecular da proteína podem ser detectados simultaneamente. De acordo com este método, detectamos com sucesso mais de um agente fibrinogenolítico ativo de sem-fim de amendoim em 6 h. Além disso, este método de fibrinogênio-PAGE é demorado e econômico. Além disso, este método pode ser usado para estudar os agentes fibrinogenolíticos dos outros organismos.
Introduction
Nos últimos anos, devido ao aumento contínuo das doenças trombóticas, as doenças trombóticas tornaram-se um novo grande problema de saúde global1. Atualmente, os antitrombóticos são classificados em três grupos: antiagregantes plaquetários, anticoagulantes e trombolíticos. Entre eles, drogas trombolíticas, como uroquinase (Reino Unido), ativador de plasminogênio tecidual (tPA), etc., são as únicas drogas clinicamente usadas que podem hidrolisar o trombo2. Enquanto isso, drogas trombolíticas mais seguras e eficazes estão sendo desenvolvidas pela identificação de novos agentes trombolíticos3.
No entanto, a identificação de novos agentes trombolíticos é demorada e trabalhosa, o que envolve principalmente as etapas de separação/purificação e caracterização/verificação. O primeiro é separar cada componente, e o último é mostrar suas atividades fibrino(geno)líticas 4,5. Em estudos anteriores, apesar do fato de termos isolado com sucesso uma nova enzima fibrino(geno)lítica (sFE) do verme do amendoim (Sipunculus nudus) por cromatografia de afinidade e ensaio de placa de fibrina (ogen) 6,7,8, esses processos são demorados e trabalhosos. Primeiro, é necessário determinar se os homogeneizados do verme do amendoim têm atividade fibrino(geno)lítica pelo método da placa de fibrina(ogênio) e produtos de reação com base na PÁGINA9. Em seguida, uma série de cromatografias, como cromatografia de troca iônica, cromatografia de filtração em gel, cromatografia de afinidade e outros métodos, devem ser realizadas para separação e purificação10,11. Posteriormente, o ensaio da placa de fibrina é realizado novamente para verificar a atividade fibrinogenolítica de cada componente separado. Finalmente, PAGE nativo e dodecil sulfato de sódio (SDS)-PAGE são realizados para determinar o peso molecular dos agentes fibrinogenolíticos ativos12. Portanto, é fundamental separar e exibir rapidamente os agentes fibrinogenolíticos ativos.
Para separar e exibir rapidamente os agentes fibrinogenolíticos ativos nos homogeneizados do verme do amendoim, um novo método de fibrinogênio-PAGE foi desenvolvido combinando os métodos de PAGE e placa de fibrinogênio, ou seja, os substratos dos agentes fibrinogenolíticos fibrinogênio foram adicionados ao gel nativo-PAGE. Após o PAGE nativo, os componentes foram separados por seu peso molecular. Enquanto isso, cada componente fibrinogenolítico ativo pode ser exibido por coloração. Por este método, detectamos com sucesso mais de um agente fibrinogenolítico ativo do homogenato do verme do amendoim em 6 h. Além disso, este método de fibrinogênio-PAGE é demorado e econômico. Além disso, este método pode ser usado para estudar os agentes fibrinogenolíticos dos outros organismos.
Protocol
Representative Results
Discussion
sFE é uma nova enzima fibrino(geno)lítica isolada de vermes de amendoim por nossa equipe anteriormente 3,6,8,13. No entanto, os processos de identificação da sFE foram demorados e trabalhosos, envolvendo as etapas de detecção da atividade fibrinogenolítica, separação dos componentes proteicos e confirmação da atividade. Como um método simples, o ens…
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi financiada pelo Departamento de Ciência e Tecnologia da cidade de Xiamen (nº 3502Z20227197), pelo Departamento de Ciência e Tecnologia da província de Fujian (nº 2019J01070; Nº 2022J01311) e Projeto de Inovação e Empreendedorismo de Talentos de Alto Nível do Plano de Ciência e Tecnologia de Quanzhou (Nº 2022C015R). Agradecemos a Fucai Wang (Universidade de Huaqiao) e Lei Tong (Universidade de Huaqiao) por sua assistência técnica.
Materials
| 1 M Tris-HCl (pH 6.8) | Solarbio | T1020 | |
| 1.5 M Tris-HCl (pH 8.8) | Solarbio | T1010 | |
| 30% Acrylamide/Bis-acrylamide | Biosharp | BL513B | |
| Ammonium persulfate | XiLONG SCIENTIFIC | 7727-54-0 | |
| Beaker | PYREX | 2-9425-02 | |
| Centrifuge Tube (1.5 mL) | Biosharp | BS-15-M | |
| Constant Temperature Incubator | JINGHONG | JHS-400 | |
| Coomas Brillant Blue Stainning solution | Beyotime | P0017F | |
| Electronic Analytical Balance | DENVER | TP-213 | |
| Fibrinogen | Solarbio | F8051 | |
| Gel loading pipette tips, Bulk | Biosharp | BS-200-GTB | |
| Homogenizer | AHS | ATS-1500 | |
| Horizontal rotation oscillator | NuoMi | NMSP-600 | |
| Milli-Q Reference | Millipore | Z00QSV0CN | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell | BIO-RAD | 165-8000~165-8007 | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine | Sigma | T9281 | |
| Pipette Tip (1 mL) | Axygene | T-1000XT-C | |
| Pipette Tip (10 µL) | Axygene | T-10XT-C | |
| Pipette Tip (200 µL) | Axygene | T-200XT-C | |
| Pipettor (1 mL) | Thermo Fisher Scientific | ZY18723 | |
| Pipettor (10µL) | Thermo Fisher Scientific | ZX98775 | |
| Pipettor (200 µL) | Thermo Fisher Scientific | ZY20280 | |
| Pipettor (50 µL) | Thermo Fisher Scientific | ZY15331 | |
| Refrigerated Centrifuge | cence | H1650R | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | V900859 | |
| Tris | Solarbio | T8060 | |
| Tris-HCl | Solarbio | T8230 | |
| Triton X-100 | Solarbio | T8200 |
Referanslar
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