Schnelle Trennung und Darstellung von aktiven fibrinogenolytischen Wirkstoffen in Sipunculus nudus durch Fibrinogen-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
Özet
Hier stellen wir ein Fibrinogen-Polyacrylamid-Gelelektrophorese-Protokoll (PAGE) vor, um die fibrinogenolytischen Wirkstoffe von Sipunculus nudus schnell zu trennen und darzustellen.
Abstract
Fibrinogenolytika, die Fibrinogen direkt auflösen können, werden häufig in der Antikoagulationsbehandlung eingesetzt. Im Allgemeinen erfordert die Identifizierung neuer fibrinogenolytischer Wirkstoffe zunächst die Trennung der einzelnen Komponenten und dann die Überprüfung ihrer fibrinogenolytischen Aktivitäten. Derzeit werden die Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) und die Chromatographie hauptsächlich in der Trennphase eingesetzt. In der Zwischenzeit werden in der Regel die auf PAGE basierenden Fibrinogenplattenassays und Reaktionsprodukte verwendet, um ihre fibrinogenolytischen Aktivitäten anzuzeigen. Wegen der räumlich-zeitlichen Trennung dieser beiden Stadien ist es jedoch unmöglich, die fibrinogenolytischen Wirkstoffe mit ein und demselben Gel zu trennen und auszustellen. Um die Trennungs- und Darstellungsprozesse der Fibrinogenolytika-Identifizierung zu vereinfachen, haben wir in dieser Studie eine neue Fibrinogen-PAGE-Methode entwickelt, um die fibrinogenolytischen Wirkstoffe von Erdnusswürmern (Sipunculus nudus) schnell zu trennen und darzustellen. Diese Methode umfasst die Fibrinogen-PAGE-Vorbereitung, Elektrophorese, Renaturierung, Inkubation, Färbung und Entfärbung. Die fibrinogenolytische Aktivität und das Molekulargewicht des Proteins können gleichzeitig nachgewiesen werden. Nach dieser Methode konnten wir innerhalb von 6 h mehr als einen aktiven fibrinogenolytischen Wirkstoff des Erdnusswurmhomogenats nachweisen. Darüber hinaus ist diese Fibrinogen-PAGE-Methode zeit- und kostensparend. Darüber hinaus könnte diese Methode verwendet werden, um die fibrinogenolytischen Wirkstoffe der anderen Organismen zu untersuchen.
Introduction
In den letzten Jahren sind thrombotische Erkrankungen aufgrund des anhaltenden Anstiegs thrombotischer Erkrankungen zu einem neuen großen globalen Gesundheitsproblem geworden1. Gegenwärtig werden Antithrombotika in drei Gruppen eingeteilt: Thrombozytenaggregationshemmer, Antikoagulanzien und Thrombolytika. Unter ihnen sind thrombolytische Medikamente wie Urokinase (UK), Gewebeplasminogenaktivator (tPA) usw. die einzigen klinisch verwendeten Medikamente, die den Thrombus2 hydrolysieren können. In der Zwischenzeit werden durch die Identifizierung neuartiger Thrombolytika sicherere und wirksamere Thrombolytika entwickelt3.
Die Identifizierung neuartiger Thrombolytika ist jedoch zeit- und arbeitsintensiv und umfasst hauptsächlich die Trenn-/Reinigungs- und Charakterisierungs-/Kontrollphasen. Ersteres dient dazu, jede Komponente zu trennen, und letzteres dient dazu, ihre fibrino(geno)lytischen Aktivitäten anzuzeigen 4,5. Obwohl es in früheren Studien gelungen ist, ein neuartiges fibrino(geno)lytisches Enzym (sFE) aus dem Erdnusswurm (Sipunculus nudus) mittels Affinitätschromatographie und Fibrin(ogen)-Plattenassay 6,7,8 zu isolieren, sind diese Prozesse sehr zeit- und arbeitsaufwändig. Zunächst ist es notwendig zu bestimmen, ob die Erdnusswurm-Homogenate eine fibrino(geno)lytische Aktivität aufweisen, und zwar nach dem Fibrin(ogen)-Plattenverfahren und den Reaktionsprodukten auf der Grundlage von SEITE9. Anschließend muss eine Reihe von Chromatographien, wie z. B. die Ionenaustauschchromatographie, die Gelfiltrationschromatographie, die Affinitätschromatographie und andere Verfahren zur Trennung und Reinigung durchgeführt werden10,11. Anschließend wird der Fibrinplatten-Assay erneut durchgeführt, um die fibrinogenolytische Aktivität jeder getrennten Komponente zu überprüfen. Schließlich werden native-PAGE und Natriumdodecylsulfat (SDS)-PAGE durchgeführt, um das Molekulargewicht der aktiven fibrinogenolytischen Wirkstoffe12 zu bestimmen. Daher ist es wichtig, die aktiven fibrinogenolytischen Wirkstoffe schnell zu trennen und anzuzeigen.
Um die aktiven fibrinogenolytischen Wirkstoffe in den Erdnusswurm-Homogenaten schnell zu trennen und darzustellen, wurde eine neue Fibrinogen-PAGE-Methode entwickelt, bei der die PAGE- und die Fibrinogenplattenmethode kombiniert wurden, d.h. die Substrate der fibrinogenolytischen Wirkstoffe Fibrinogen wurden dem nativen PAGE-Gel zugesetzt. Nach native-PAGE wurden die Komponenten nach ihrem Molekulargewicht getrennt. In der Zwischenzeit kann jede aktive fibrinogenolytische Komponente durch Färben dargestellt werden. Mit dieser Methode konnten wir innerhalb von 6 h mehr als einen aktiven fibrinogenolytischen Wirkstoff des Erdnusswurm-Homogenats nachweisen. Darüber hinaus ist diese Fibrinogen-PAGE-Methode zeit- und kostensparend. Darüber hinaus könnte diese Methode verwendet werden, um die fibrinogenolytischen Wirkstoffe der anderen Organismen zu untersuchen.
Protocol
Representative Results
Discussion
sFE ist ein neuartiges fibrino(geno)lytisches Enzym, das von unserem Team zuvor aus Erdnusswürmern isoliert wurde 3,6,8,13. Die Identifizierungsprozesse von sFE waren jedoch zeit- und arbeitsaufwendig und umfassten den Nachweis der fibrinogenolytischen Aktivität, die Trennung der Proteinkomponenten und die Aktivitätsbestätigungsphasen. Als einfache Methode …
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde vom Science and Technology Bureau der Stadt Xiamen (Nr. 3502Z20227197), dem Science and Technology Bureau der Provinz Fujian (Nr. 2019J01070; Nr. 2022J01311) und High-Level Talents Innovation and Entrepreneurship Project des Quanzhou Science and Technology Plan (Nr. 2022C015R). Wir danken Fucai Wang (Huaqiao University) und Lei Tong (Huaqiao University) für ihre technische Unterstützung.
Materials
| 1 M Tris-HCl (pH 6.8) | Solarbio | T1020 | |
| 1.5 M Tris-HCl (pH 8.8) | Solarbio | T1010 | |
| 30% Acrylamide/Bis-acrylamide | Biosharp | BL513B | |
| Ammonium persulfate | XiLONG SCIENTIFIC | 7727-54-0 | |
| Beaker | PYREX | 2-9425-02 | |
| Centrifuge Tube (1.5 mL) | Biosharp | BS-15-M | |
| Constant Temperature Incubator | JINGHONG | JHS-400 | |
| Coomas Brillant Blue Stainning solution | Beyotime | P0017F | |
| Electronic Analytical Balance | DENVER | TP-213 | |
| Fibrinogen | Solarbio | F8051 | |
| Gel loading pipette tips, Bulk | Biosharp | BS-200-GTB | |
| Homogenizer | AHS | ATS-1500 | |
| Horizontal rotation oscillator | NuoMi | NMSP-600 | |
| Milli-Q Reference | Millipore | Z00QSV0CN | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell | BIO-RAD | 165-8000~165-8007 | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine | Sigma | T9281 | |
| Pipette Tip (1 mL) | Axygene | T-1000XT-C | |
| Pipette Tip (10 µL) | Axygene | T-10XT-C | |
| Pipette Tip (200 µL) | Axygene | T-200XT-C | |
| Pipettor (1 mL) | Thermo Fisher Scientific | ZY18723 | |
| Pipettor (10µL) | Thermo Fisher Scientific | ZX98775 | |
| Pipettor (200 µL) | Thermo Fisher Scientific | ZY20280 | |
| Pipettor (50 µL) | Thermo Fisher Scientific | ZY15331 | |
| Refrigerated Centrifuge | cence | H1650R | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | V900859 | |
| Tris | Solarbio | T8060 | |
| Tris-HCl | Solarbio | T8230 | |
| Triton X-100 | Solarbio | T8200 |
Referanslar
- Bikdeli, B., et al. COVID-19 and thrombotic or thromboembolic disease: Implications for prevention, antithrombotic therapy, and follow-up. J Am Coll Cardiol. 75 (23), 2950-2973 (2020).
- Tsivgoulis, G., et al. Thrombolysis for acute ischaemic stroke: current status and future perspectives. Lancet Neurol. 22 (5), 418-429 (2023).
- Tang, M., Hu, C., Lin, H., Yan, H. Fibrinolytic drugs induced hemorrhage: mechanisms and solutions. Blood Coagul Fibrinolysis. 34 (5), 263-271 (2023).
- Lu, M., et al. Purification, characterization, and chemical modification of Bacillus velezensis SN-14 fibrinolytic enzyme. Int J Biol Macromol. 177, 601-609 (2021).
- Abu-Tahon, M. A., Abdel-Majeed, A. M., Ghareib, M., Housseiny, M. M., Abdallah, W. E. Thrombolytic and anticoagulant efficiencies of purified fibrinolytic enzyme produced from Cochliobolus hawaiiensis under solid-state fermentation. Biotechnol Appl Biochem. 70 (6), 1954-1971 (2023).
- Lin, W., Lin, H., Xin, P., Yan, H., Kang, B., Tang, M. A Comprehensive approach to analyze the cell components of cerebral blood clots. J Vis Exp. (197), e65791 (2023).
- Tang, M., Lin, H., Hu, C., Yan, H. Affinity purification of a fibrinolytic enzyme from Sipunculus nudus. J Vis Exp. (196), e65631 (2023).
- . Plasmin affinity purification method based on agarose gel and plasmin and application thereof Available from: https://patents.google.com/patent/CN116103270A/en?oq=CN202310108470 (2023)
- Walton, P. L. An improved fibrin plate method for the assay of plasminogen activators. Clinica Chimica Acta. 13 (5), 680-684 (1966).
- Ngere, J. B., Ebrahimi, K. H., Williams, R., Pires, E., Walsby-Tickle, J., McCullagh, J. S. O. Ion-exchange chromatography coupled to mass spectrometry in life science, environmental, and medical research. Anal Chem. 95 (1), 152-166 (2023).
- Kato, S., Takeuchi, K., Iwaki, M., Miyazaki, K., Honda, K., Hayashi, T. Chitin- and streptavidin-mediated affinity purification systems: A screening platform for enzyme discovery. Angew Chem Int Ed Engl. 62 (31), e202303764 (2023).
- Sharma, N., Sharma, R., Rajput, Y. S., Mann, B., Singh, R., Gandhi, K. Separation methods for milk proteins on polyacrylamide gel electrophoresis: Critical analysis and options for better resolution. International Dairy Journal. 114, 104920 (2021).
- . Preparation and application of natural fibrinolytic enzyme from peanut worm Available from: https://patents.google.com/patent/CN109295042A/en (2019)
.