クライオ電子顕微鏡サンプル調製のためのストレプトアビジン-アフィニティーグリッド作製

1. 試薬の調製 市販のストレプトアビジンを結晶化バッファー(50 mM HEPES pH 7.5、150 mM KCl、5 mM EDTA、10%トレハロース)で最終濃度0.5 mg/mLに希釈します。最終的なトレハロース濃度が10%であることを確認してください。25〜50μLのアリコートを液体窒素中で急速凍結し、-80°Cで保存します。 1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(ビオチニル)ナトリウム塩を65:35:8 v/v/vクロロホルム/メタノール/水溶媒に溶解し、最終脂質濃度を1 mg/mLにします。20〜30μLの単回使用アリコートを-80°Cでガラスバイアルに保管してください。注:溶媒の調製は、重量で行うとより正確になります。まず、1.85gの超純水と6.41gの高速液体クロマトグラフィー(HPLC)グレードのメタノールを混ぜ合わせ、これを22.42gのクロロホルムに加えて溶媒を調製します。注意: このプロトコルを開始する前に、クロロホルムおよびメタノール有機溶剤の取り扱いと廃棄に関するメーカーの安全データシートと推奨手順を読み、理解してください。メタノールが皮膚に直接触れないようにしてください。 2. グリッドの前処理 100%クロロホルムに2回、100%エタノールに1回浸して、金メッシュグリッド上のカーボンホイルを洗浄します。グリッドをきれいな濾紙の上に置いて乾かします。洗浄プロセスを合計3サイクル繰り返します。注:0.6〜2μmの範囲の穴サイズで厚さ10〜12nmのカーボンフィルム(材料リストを参照)を持つ市販のカーボンフォイルグリッドで再現性のある成功が達成されています。市販の金箔グリッドと、ルービンシュタイン研究所のナノファブリケーションプロトコル14 に従って調製された自家製の穴あき炭素グリッドも成功裏に使用されています。炭素膜が薄い市販のグリッドでは、再現性の低い結果が得られています。銅はサンプル中の有機アミンと反応するため、銅グリッドは使用しないでください。 グリッドが乾いたら、2.5〜5nmの厚さの炭素層を穴のある炭素グリッドの炭素側に蒸発させます。炭素の厚さは、 材料表 ファイルで提供されている炭素蒸発器に組み込まれている水晶の膜厚測定によって制御されます。 新しく蒸発した炭素を1週間熟成させる(つまり、疎水性を高める)のを待ちます。 3. ストレプトアビジン格子の調製 注:ホール状炭素EMグリッド上で2Dストレプトアビジン結晶を成長させるには、まず、ビオチン化脂質単層をLangmuir-Schaefer転写により炭素膜の正孔に塗布します(図1B)。脂質単層は、その後の工程に従って形成されます(図2)。タルカムパウダーはヒマシ油とシャーレの間に境界を作り、ヒマシ油の薄い層は、脂質単層が形成されるときに一定の表面圧力を維持するのに役立ちます。ステップ2.2で蒸発した炭素を含む側を使用して単層をピックアップし、余分な脂質を結晶化バッファーで洗い流し、ストレプトアビジン溶液をグリッド上でインキュベートして結晶化します。 ベンチエリアを70%エタノールで清掃します。 5 μLのガラスシリンジをクロロホルムで数回すすぎ、洗浄します。使用前にシリンジを完全に乾かしてください。 炭素蒸発したグリッドを、使用直前に100%エタノールに浸して再度洗浄します。グリッドをきれいな濾紙で乾かします。 グリッドが乾燥している間に、各毛細血管防止ピンセットを100%クロロホルムと100%エタノールで洗います。ピンセットを完全に乾かします。 パラフィルムの清浄な面で、作製するグリッドごとに50 μLの結晶化バッファー(50 mM HEPES pH 7.5、150 mM KCl、5 mM EDTA、10%トレハロース)を3滴調製します。 コーティングされていない35 mmのシャーレの蓋に結晶化緩衝液(50 mM HEPES pH 7.5、150 mM KCl、5 mM EDTA、10%トレハロース)を入れます。レンズペーパーで表面をきれいにします。 ペトリ皿の周囲に科学グレードのタルカムパウダーを振りかけます。これは、次のステップで、ヒマシ油がどこまで広がったかを示す指標として機能します。十分なタルカムパウダーを追加して、ヒマシ油がペトリ皿の端に触れないように保護するバリアを作成します。タルカムパウダーを添加しすぎると、脂質単層を作るための利用可能なスペースが制限されます。 200 μLのピペットチップをヒマシ油に浸し、ピペットチップからぶら下がる中程度の滴(約20 μL)を得ます。この滴をペトリ皿の緩衝液の表面に触れると、広がりが広がり、均一な膜を形成します。得られた油の薄膜は、脂質単層が形成されるときに一定の表面圧力を維持するピストン15として機能します(ステップ3.10)。注:ひまし油は少なすぎるのではなく、十分な量を加えることが重要であり、1滴として加えることをお勧めします。脂質単層を作る前に、ひまし油を完全に広げてください。 5 μLのガラスシリンジを溶解した脂質で1〜2回すすぎ、アリコートを使用して使用してください。シリンジを満たす脂質に気泡を作らないでください。.注意: ガラスシリンジは、ステップ3.2から残留クロロホルムが残っている場合に備えて、溶解した脂質ですすいでください。残留クロロホルムは、得られる単層の品質に影響を与える可能性があります。 シリンジから可能な限り最小の容量(~0.5 μL)の脂質を分注し、ぶら下がっている液滴をヒマシ油膜の表面にそっと触れます。.なお、脂質溶液は接触点でヒマシ油膜を突き破り、得られた脂質単層はヒマシ油の薄膜の中心に円を形成する。脂質を数滴順に加えるか、グリッドを作成した後に脂質を追加しますが、添加しすぎると、脂質はヒマシ油の境界を越えて、タルカムパウダーと汚染された界面活性剤が隔離された周囲に広がります。これが発生した場合は、プロセスを再起動する必要があります。 毛細管現象防止ピンセットでグリッドをピックアップし、ピンセットのまっすぐなアームとグリッドの炭素蒸発側の両方が単層に面するようにします。 グリッドの炭素蒸発面を単層に1〜2秒間接触させることにより、単層の一部を穴の開いた炭素に転写します。注:転送が成功すると、グリッドの表面が親水性になり、ペトリ皿から持ち上げられた後、薄い球形のバッファーキャップがグリッド全体を覆うようになります。 グリッドに接着したバッファーの球状キャップを、ステップ3.5でパラフィルム上に調製した3つの50 μL滴の結晶化バッファーに、それぞれ1秒間連続して接触させます。注:このステップでは、サンプルを電子顕微鏡で観察したときに脂質小胞の形成を避けるために、球状キャップの表面(以前の疎水性炭素膜ではなく)を覆う余分な脂質を可能な限り除去しようとします。 4 μL の 0.5 mg/mL ストレプトアビジンを、グリッド上の結晶化バッファーの残りの球状キャップに慎重に添加します。 グリッドを湿度チャンバーに入れます。手順 3.11 から 3.14 をグリッドのバッチ全体に対して繰り返します。 蒸発を防ぐために、グリッドを室温(RT)で湿度チャンバー内で2時間インキュベートします。注意: グリッドの金面は、単層を適用した後、どの時点でも濡れないことが重要です。 2時間のインキュベーション後、パラフィルムの清浄な面のグリッドごとに、300 μLのリンスバッファー(10 mM HEPES、pH 7.5、50 mM KCl、5 mM EDTA、10%トレハロース)を1滴調製します。注:リンスバッファーには、ステップ3.5〜3.6で使用した結晶化バッファーに含まれる150 mM KClではなく、50 mM KClが含まれています。 過剰な(結合していない)ストレプトアビジンを、300 μL滴のリンスバッファーの上にグリッドを置いて洗浄します。手順 3.18 から 3.20 を一度に 1 つのグリッドに対して実行します。グリッドを300 μLのリンスバッファードロップに長時間放置することは避けてください。注:この時点ではストレプトアビジン結晶/単層が壊れやすいため、洗浄は1回のみ行われます。グリッドが洗浄バッファーの滴の表面から持ち上げられるたびに、グリッドと洗浄液滴の間の液体ブリッジが破裂します。破断時には、炭素膜の開孔に広がる自立した単層結晶に過渡的な圧力勾配(吸引圧力)が加わります。この吸引圧力により、単層結晶の過渡的なドーム化が起こり、結晶が被覆する面積が拡大することが予想されます。面積の増加が結晶の弾性限界を超えると、結晶が破損したり乱れたりすることがあります。 糸くずの出ないワイプですぐに毛細管防止ピンセットを乾かし、次の手順でグリッドをろ紙に解放しやすくします。抗毛細管ピンセットのよじれたアームを滴に突き刺して、すすぎ緩衝液の滴に浮かんでいるグリッドを拾います。 余分な緩衝液をろ紙で側面からやさしく拭き取ります。金面を下にしてグリッドをろ紙の上に置き、グリッドごとに手順3.18〜3.20を繰り返し、グリッドを15〜20分間乾かします。 グリッドが乾いたら、金色の面が上を向くように裏返します。炭素の薄い層(厚さ約0.5〜2 nm)をグリッドの金面に蒸発させます。注:グリッドは一定の湿度で保管し、その値は重要ではないようですが、相対湿度の複数の変化により、膨張と収縮のサイクルが発生することが予想されることに注意してください。グリッドの裏面の疎水性は単層の安定性にとって重要である可能性があるため、最良の結果を得るには、クライオ電子顕微鏡を使用する前にグリッドを1週間熟成させます。グリッドは長期間安定していますが、3か月後には裏面の炭素の疎水性が低下する可能性があります。 4.ネガティブステインによるストレプトアビジンアフィニティーグリッドバッチ品質の確認 パラフィルムの清浄な面に、50 μLの2滴と100 μLのサンプルバッファー(50 mM HEPES pH 7.5、50 mM KCl、0.5 mM TCEP)を1滴調製します。 トレハロースを除去し、ストレプトアビジングリッドを 2 つの 50 μL 滴に触れて再水和し、グリッドを 100 μL 滴のサンプルバッファーに 10 分間浮かせます。注:再水和およびその後のサンプル結合インキュベーション中は、界面活性剤の使用を避けるのが最善です。緩衝液はグリッドの金面に分散し、余分なサンプルを除去するための洗浄の効率を制限します。 水分補給後、毛細血管防止ピンセットでグリッドを持ち上げて、抗毛細血管ピンセットのよじれた腕がドロップに入るようにします。 余分なバッファーを側面から静かに吸い取り、4 μLの75-100 nMサンプル(オプション)をすばやく再適用します。注意: 水分補給後はグリッドを乾かさないでください。 サンプルを湿度チャンバーで1〜5分間インキュベートします。注:濃度とインキュベーション時間はサンプルに依存するため、最適化する必要があります。提供されたサンプル濃度とインキュベーション時間は、推奨される開始点です。 パラフィルムのクリーンな面に、サンプルバッファーと1%ギ酸ウラニル(UF)染色剤をそれぞれ30 μLずつ4滴垂らします。注意: この手順を実行する前に、ギ酸ウラニルの取り扱いと廃棄に関するメーカーの安全データシートと推奨手順を読んで理解してください。ギ酸ウラニルは有毒で放射性化合物です。放射性物質の使用については、必ず事前に機関の許可を得てください。 4滴のサンプルバッファーのそれぞれに触れて、結合していないサンプルを洗い流します。 UFによる標準的なネガティブ染色法を用いてサンプルを染色します。側面からUFの汚れをそっと拭き取り、グリッドに非常に厚い汚れの層を残します。ブロッティング後にさらに0.5 μLの染色剤をグリッドに塗布し、必要に応じて染色剤を厚くすることができます。グリッドを風乾させます。注:ストレプトアビジングリッドは非常に親水性であるため、ネガティブ染色は、グロー放電処理された連続カーボングリッドを使用する場合に一般的に見られるものとは対照的に、どこにでも非常に均一な膜を形成する傾向があります。そのため、ステイン液の膜を厚く残すことをお勧めします。 5. ビオチン化サンプルによるストレプトアビジンアフィニティーグリッドの凍結 注:次の手順は、ブロッティングセンサーを内蔵した片面自動プランジャーを対象としています(他の自動プランジ装置での片側手動ブロッティングも可能です) パラフィルムの清浄な面に、50 μLを2滴、100 μLを1滴のサンプルバッファー(例:50 mM HEPES pH 7.5、50 mM KCl、0.5 mM TCEP)を調製します。 ストレプトアビジンのグリッドを 2 つの 50 μL 滴に触れて再水和し、グリッドを 100 μL 滴のサンプルバッファーに 10 分間浮かせます。 水分補給後、毛細血管防止ピンセットでグリッドを持ち上げて、抗毛細血管ピンセットのよじれた腕がドロップに入るようにします。 余分なバッファーを側面から静かに吸い取り、4 μLの75-100 nMサンプルをすばやく適用します。 サンプルを湿度チャンバーで1〜5分間インキュベートします。注:繰り返しになりますが、濃度とインキュベーション時間はサンプルに依存するため、最適化する必要があります。提供されたサンプル濃度とインキュベーション時間は、推奨される開始点です。低濃度のサンプルの場合、より長い期間インキュベートしたり、サンプルをグリッドに数回結合させたりすることができます。 パラフィルムの清浄な面に、10 μLの凍結緩衝液(例:50 mM HEPES pH 7.5、50 mM KCl、0.5 mM TCEP、3%トレハロース、0.01% NP40)を2滴調製します。インキュベーション後、凍結バッファーの最初の滴にグリッドを接触させて、結合していないサンプルを洗浄します。グリッドを凍結バッファーの 2 番目のドロップにドロップします。 片側自動プランジャーに取り付けられたピンセットでグリッドの端をすばやくつかみます。余分なバッファーを穏やかに吸い取り、4 μLの凍結バッファー(50 mM HEPES pH 7.5、50 mM KCl、0.5 mM TCEP、3%トレハロース、0.01% NP40)をグリッドにすばやく適用します。 片側自動プランジャーにピンセットを取り付けます。最良の結果は、4〜6秒のブロット時間でグリッド上の液滴を検出するブロットセンサーを使用して得られました。使用するサンプルや緩衝液によって条件が異なります。 6. ストレプトアビジンアフィニティーグリッドから収集したクライオ電子顕微鏡動画のデータ処理 ストレプトアビジンアフィニティーグリッドのデータ収集は、標準的なグリッドと同様に行うことができ、特別な顕微鏡調整は必要ありません。しかしながら、ここで詳述する手順は、顕微鏡写真の動きを補正した後にのみストレプトアビジンシグナルを除去する。そのため、元のムービーフレームに依存する粒子研磨などのデータ処理工程を確実に行うことができない。ストレプトアビジンシグナルの減算 (CTF 推定を除くすべての標準ダウンストリーム処理に必要) には、Linux 環境で実行されている Matlab バージョン R2014b 以降が必要です。シグナルの減算は、ストレプトアビジン層の結晶性に依存しているため、ピークマスキングが可能になり、各顕微鏡写真のフーリエ変換からシグナルを除去することができます。 処理スクリプトのセットアップ補足ファイルからプロジェクトディレクトリ内の専用フォルダにすべてのファイルをコピーします 次のファイルを含む processing_scripts というディレクトリを準備します。lsub.m (Supplemental Coding File 1、減算スクリプト)process_subtration.sh (Supplemental Coding File 2; 利用可能なすべての顕微鏡写真をループ処理し、並列ジョブを生成し、入力と出力を追跡するラッパースクリプト)process_subtraction.cfg (補足コーディングファイル 3、減算ジョブのパラメータを含む設定ファイル、6.2 を参照) 次のファイルを含む support_scripts というディレクトリを準備します。bg_drill_hole.m (補足コーディング ファイル 4)bg_FastSubtract_standard.m (補足コーディングファイル 5)bg_Pick_Amp_masked_standard.m (補足コーディング・ファイル 6)bg_push_by_rot.m (補足コーディング・ファイル7)ReadMRC.m (補足コーディング・ファイル 8)WriteMRC.m (補足コーディング・ファイル 9)WriteMRCHeader.m (補足コーディング ファイル 10) 必要に応じて、構成ファイル(process_subtraction.cfg( 図3を参照))を調整します。入力: mrc形式のモーション補正顕微鏡写真を含むディレクトリへのパス。ディレクトリまたはワイルドカード (?、*) を含むパターンを使用します。例：input=”/path/to/project_directory/micrographs/”又はinput=”/path/to/project_directory/micrographs/*.mrc” output_dir: 格子を差し引いた顕微鏡写真を書き込むディレクトリへのパス。 only_do_unfinished: 既存の減算顕微鏡写真を上書きまたはスキップする場合は、(true|false)を指定します。このパラメータは、顕微鏡セッションの途中で格子減算スクリプトを開始するのに便利です(デフォルト: true)。 num_parallel_jobs: 並列ジョブの数を指定します。この数は、処理に使用されるハードウェアの仕様によって異なり、使用可能なコアの数を超えてはなりません。32 コアとネットワークファイルシステムを持つシステムでは、14 個の並列ジョブで最適なパフォーマンスが達成されました。最高のパフォーマンスを得るには、顕微鏡写真のサブセットを使用してこの値を最適化します。 Pad_Origin_X:縦向き(画像幅画像の高さ)のK3検出器の場合は1000。FFTは正方形のボックスで実行され、検出器の寸法が正方形でない場合はパディングが必要です。 Pad_Origin_Y:縦向きのK3検出器(画像の幅画像の高さ)で使用する場合は200。 Inside_Radius_Ang (90) と Outside_Radius_Ang (3.0) は変更しないでください。格子減算は、2つの解像度(単位はオングストローム)の間で実行されます。 Pixel_Ang: ピクセル サイズを浮動小数点値として指定します。 閾値: フーリエ空間の背景で格子を置き換える減算閾値のカットオフ値。正常に使用される値は 1.4 から 1.6 の間です。開始点として 1.42 を使用します。 expand_pixel (10) と pad_out_opt (0) は変更しないでください。expand_pixelは、しきい値のカットオフよりも高い値を持つピクセルの周囲をマスクするために使用される直径の値です。pad_out_opt は、パディングされた領域を出力に含めるかどうかを決定するオプションです。 addpath_m: サポート スクリプトへのパス。 path_to_matlab_bin: システムの Matlab インストール bin ディレクトリへのパス。 path_matlab_script: 上記の手順 6.1.2 でコピーした MATLAB 減算スクリプト (lsub.m) へのパス。 変更したスクリプトを保存した後、スクリプト(bash ./process_subtraction.sh )を実行して、入力顕微鏡写真からストレプトアビジンシグナルを差し引きます。パラメータonly_do_unfinishedがtrueに設定されている場合、スクリプトを中断または再起動できます(ステップ6.2.3を参照)。エラーが発生した場合は、bash スクリプトで指定されているパラメーターを確認します。パラメーター変数とそれに割り当てられた値の間に意図しないスペースがないことを確認してください (これは間違いの一般的な原因であるため)。 格子減算された画像を標準的なクライオ電子顕微鏡画像処理に使用します。