Medición de la longitud de la cola de Poly A a partir del cerebro y la línea celular de la larva de Drosophila

La mayoría de los ARNm eucariotas están poliadenilados postranscripcionalmente en su extremo 3′ en el núcleo mediante la adición de adenosinas no moldeadas por poli(A) polimerasas canónicas. Una cola de poli(A) intacta es fundamental a lo largo del ciclo de vida del ARNm, ya que es esencial para la exportación nuclear de ARNm¹, facilita la interacción con las proteínas de unión a poli(A) para mejorar la eficiencia de la traducción² e imparte resistencia contra la degradación³. En ciertos casos, la cola de poli(A) también puede sufrir una extensión en el citoplasma, facilitada por poli(A) polimerasas no canónicas⁴. En el citoplasma, la longitud de la cola de poli (A) cambia dinámicamente e influye en la vida útil de la molécula de ARNm. Numerosas polimerasas y deadenilasas son conocidas por modular la longitud de la cola ^5,6,7. Por ejemplo, el acortamiento de las colas de poli(A) se correlaciona con la represión de la traducción, mientras que el alargamiento de las colas de poli(A) mejora la traslación ^8,9.

Los estudios genómicos acumulados han demostrado la importancia fundamental de la longitud de la cola de poli(A) en varias facetas de la biología eucariota. Esto incluye el papel en el desarrollo de las células germinales, el desarrollo embrionario temprano, la plasticidad sináptica neuronal para el aprendizaje y la memoria, y la respuesta inflamatoria¹⁰. Se han desarrollado numerosos métodos y ensayos para medir las longitudes de la cola de poli(A). Por ejemplo, el ensayo RNasa H/oligo(dT) aprovecha la RNasa H en presencia o ausencia de oligo(dT) para estudiar la longitud de la cola de poli(A) ^11,12. Otros métodos para estudiar la cola de poli(A) incluyen la amplificación por PCR de los extremos 3′, como la prueba de amplificación rápida de los extremos del ADNc (RACE-PAT)^12,13 y la prueba de poli(A) mediada por ligasa (LM-PAT)¹⁴. Otras modificaciones del ensayo PAT incluyen ePAT¹⁵ y sPAT¹⁶. El G-tailing^{enzimático 17,18} o el G/I tailing del extremo 3′ son otras variaciones del ensayo PAT. La modificación adicional de estas técnicas incluye el uso de cebadores marcados con fluorescencia junto con electroforesis en gel capilar para el análisis de alta resolución, lo que se conoce como prueba de poli(A) de alta resolución (Hire-PAT)¹⁹. Estos ensayos impulsados por PCR permiten una cuantificación rápida y de alta sensibilidad de la longitud del poli(A).

Con el desarrollo de la secuenciación de próxima generación, un método de secuenciación de alto rendimiento, como PAL-seq²⁰ y TAIL-seq²¹, permite realizar análisis de poliadenilación a escala de todo el transcriptoma. Sin embargo, estos métodos solo proporcionan lecturas cortas de secuenciación de 36-51 nucleótidos. Por lo tanto, FLAM-Seq²² se desarrolló para el perfil global de la longitud de la cola del ARNm de longitud completa y proporciona lecturas largas. La tecnología Nanopore²³ proporciona secuenciación directa de ARN o ADNc independiente de la PCR para estimaciones de la longitud de la cola poli(A). Sin embargo, estos métodos de alto rendimiento no están exentos de limitaciones. Requieren grandes cantidades de materiales de partida, son caros y requieren mucho tiempo. Además, el análisis de transcripciones raras puede ser extremadamente difícil con los métodos de alto rendimiento, y los métodos basados en PCR de bajo rendimiento siguen proporcionando una ventaja cuando es necesario analizar un pequeño número de transcripciones, para experimentos piloto y validación de otros métodos.

Recientemente hemos demostrado que los ARNm de Dscam1 contienen colas cortas de poli(A) en Drosophila, lo que requiere una unión no canónica de la proteína de unión a poli(A) citoplasmática en Dscam1 3’UTR utilizando el método de relaves G/I²⁴. Aquí proporcionamos un procedimiento simplificado para la preparación de tejidos y la cuantificación de la longitud poli(A) de los ARNm del sistema nervioso de Drosophila y las células S2 de Drosophila .