Medição do comprimento da cauda de Poly A do cérebro da larva de Drosophila e da linha celular

A maioria dos mRNAs eucarióticos são pós-transcricionalmente poliadenilados, em seu término 3′ no núcleo, pela adição de adenosinas não moldadas por poli(A) polimerases canônicas. Uma cauda poli(A) intacta é fundamental durante todo o ciclo de vida do mRNA, pois é essencial para a exportação nuclear de mRNA¹, facilita a interação com proteínas ligadoras de poli(A) para aumentar a eficiência translacional² e confere resistência contra a degradação³. Em certos casos, a cauda de poli(A) também pode sofrer extensão no citoplasma, facilitada por poli(A) polimerases não^canônicas4. No citoplasma, o comprimento da cauda do poli(A) muda dinamicamente e influencia o tempo de vida da molécula de RNAm. Numerosas polimerases e deadenilases são conhecidas por modular o comprimento da cauda ^5,6,7. Por exemplo, o encurtamento das caudas poli(A) correlaciona-se com a repressão translacional, enquanto o alongamento das caudas poli(A) aumenta a tradução ^8,9.

Estudos genômicos acumulados têm demonstrado a importância fundamental do comprimento da cauda poli(A) em várias facetas da biologia eucariótica. Isso inclui papéis no desenvolvimento de células germinativas, desenvolvimento embrionário inicial, plasticidade sináptica neuronal para aprendizagem e memória, e a resposta inflamatória¹⁰. Existem inúmeros métodos e ensaios desenvolvidos para medir o comprimento da cauda do poli(A). Por exemplo, o ensaio RNase H/oligo(dT) aproveita a RNase H na presença ou ausência de oligo(dT) para estudar o comprimento da cauda do poli(A)^11,12. Outros métodos para estudar a cauda poli(A) incluem a amplificação por PCR das extremidades 3′, como o teste de amplificação rápida das extremidades do cDNA poli(A) (RACE-PAT^)12,13 e o teste poli(A) mediado por ligase (LM-PAT)¹⁴. Outras modificações do ensaio PAT incluem ePAT¹⁵ e sPAT¹⁶. A cauda G enzimática^17,18 ou a cauda G/I da extremidade 3′ são outras variações do ensaio PAT. Outras modificações dessas técnicas incluem o uso de primers fluorescentemente marcados juntamente com eletroforese em gel capilar para análise de alta resolução, conhecido como teste de poli(A) de alta resolução (Hire-PAT)¹⁹. Estes ensaios conduzidos por PCR permitem a quantificação rápida e de alta sensibilidade do comprimento poli(A).

Com o desenvolvimento do sequenciamento de última geração, um método de sequenciamento de alto rendimento, como o PAL-seq²⁰ e o TAIL-seq²¹, permite análises de poliadenilação em escala de transcriptoma. No entanto, esses métodos fornecem apenas leituras curtas de sequenciamento de 36-51 nucleotídeos. Portanto, o FLAM-Seq²² foi desenvolvido para o perfil global do comprimento da cauda do mRNA de comprimento total e fornece leituras longas. A tecnologia de nanoporos²³ fornece sequenciamento direto de RNA ou cDNA independente de PCR para estimativas do comprimento da cauda de poli(A). No entanto, esses métodos de alto rendimento não são isentos de limitações. Eles exigem grandes quantidades de materiais de partida, são caros e demorados. Além disso, a análise de transcrições raras pode ser extremamente desafiadora com métodos de alto rendimento, e métodos baseados em PCR de baixo rendimento ainda fornecem uma vantagem quando um pequeno número de transcritos precisa ser analisado, para experimentos piloto e validação de outros métodos.

Recentemente, demonstramos que os mRNAs de Dscam1 contêm caudas curtas de poli(A) em Drosophila, o que requer uma ligação não canônica da proteína de ligação citoplasmática poli(A) em Dscam1 3’UTR usando o método de rejeito G/I²⁴. Aqui nós fornecemos um procedimento simplificado para a preparação de tecidos e quantificação do comprimento poli(A) de mRNAs do sistema nervoso Drosophila e células Drosophila S2.