Mesure de la longueur de la queue Poly A à partir du cerveau et de la lignée cellulaire des larves de drosophile

La plupart des ARNm eucaryotes sont polyadénylés post-transcriptionnel à leur extrémité 3′ dans le noyau par l’ajout d’adénosines non matricielles par des poly(A) polymérases canoniques. Une queue poly(A) intacte est essentielle tout au long du cycle de vie de l’ARNm, car elle est essentielle à l’exportation nucléaire de l’ARNm¹, facilite l’interaction avec les protéines de liaison poly(A) pour améliorer l’efficacité de la traduction² et confère une résistance à la dégradation³. Dans certains cas, la queue poly(A) peut également subir une extension dans le cytoplasme, facilitée par des poly(A) polymérases non canoniques⁴. Dans le cytoplasme, la longueur de la queue poly (A) change dynamiquement et influence la durée de vie de la molécule d’ARNm. De nombreuses polymérases et deadenylases sont connues pour moduler la longueur de la queue ^5,6,7. Par exemple, le raccourcissement des queues poly(A) est corrélé à la répression traductionnelle, tandis que l’allongement des queues poly(A) améliore la traduction ^8,9.

De plus en plus d’études génomiques ont démontré l’importance fondamentale de la longueur de la queue poly(A) dans diverses facettes de la biologie eucaryote. Cela inclut les rôles dans le développement des cellules germinales, le développement embryonnaire précoce, la plasticité synaptique neuronale pour l’apprentissage et la mémoire, et la réponse inflammatoire¹⁰. De nombreuses méthodes et tests ont été développés pour mesurer les longueurs de queue poly(A). Par exemple, le test RNase H/oligo(dT) tire parti de la RNase H en présence ou en absence d’oligo(dT) pour étudier la longueur de la queue poly(A)^11,12. D’autres méthodes d’étude de la queue poly(A) comprennent l’amplification par PCR des extrémités 3′, comme l’amplification rapide des extrémités de l’ADNc, le test poly(A) (RACE-PAT)^12,13 et le test poly(A) médié par la ligase (LM-PAT)¹⁴. D’autres modifications du test PAT incluent ePAT¹⁵ et sPAT¹⁶. La queue enzymatique^{G 17,18} ou la queue G/I de l’extrémité 3′ sont d’autres variantes du test PAT. D’autres modifications de ces techniques comprennent l’utilisation d’amorces marquées par fluorescence ainsi que l’électrophorèse sur gel capillaire pour l’analyse à haute résolution, appelée test poly(A) à haute résolution (Hire-PAT)¹⁹. Ces tests basés sur la PCR permettent une quantification rapide et haute sensibilité de la longueur du poly(A).

Avec le développement du séquençage de nouvelle génération, une méthode de séquençage à haut débit, telle que PAL-seq²⁰ et TAIL-seq²¹, permet des analyses de polyadénylation à l’échelle du transcriptome. Cependant, ces méthodes ne fournissent que de courtes lectures de séquençage de 36 à 51 nucléotides. Par conséquent, FLAM-Seq²² a été développé pour le profilage global de la longueur de la queue de l’ARNm pleine longueur et fournit des lectures longues. La technologie Nanopore²³ fournit un séquençage direct de l’ARN ou de l’ADNc indépendant de la PCR pour les estimations de la longueur de la queue poly(A). Cependant, ces méthodes à haut débit ne sont pas sans limites. Ils nécessitent de grandes quantités de matières premières, sont coûteux et prennent du temps. De plus, l’analyse de transcrits rares peut être extrêmement difficile avec les méthodes à haut débit, et les méthodes basées sur la PCR à faible débit offrent toujours un avantage lorsqu’un petit nombre de transcrits doivent être analysés, pour des expériences pilotes et la validation d’autres méthodes.

Nous avons récemment démontré que les ARNm de Dscam1 contiennent de courtes queues poly(A) chez la drosophile, ce qui nécessite une liaison non canonique de la protéine cytoplasmique de liaison poly(A) sur Dscam1 3’UTR en utilisant la méthode de queue G/I²⁴. Nous proposons ici une procédure simplifiée pour la préparation des tissus et la quantification de la longueur poly(A) des ARNm du système nerveux de la drosophile et des cellules S2 de la drosophile .