果 蝇 幼虫脑和细胞系的Poly A尾长测量
Özet
该协议描述了一种有效且可靠的方法，用于量化 果蝇 神经系统中目的基因的poly（A）长度，该方法可以很容易地适应来自其他物种的组织或细胞类型。
Abstract
聚腺苷酸化是一种重要的转录后修饰，可将 poly（A） 尾部添加到 mRNA 分子的 3′ 末端。poly（A）尾巴的长度受细胞过程的严格调节。mRNA 多聚腺苷酸化的失调与异常基因表达和各种疾病有关，包括癌症、神经系统疾病和发育异常。因此，了解多聚腺苷酸化的动力学对于揭示 mRNA 加工和转录后基因调控的复杂性至关重要。
本文介绍了一种测量从 果蝇 幼虫脑和 果蝇 施耐德 S2 细胞中分离的 RNA 样品中 poly（A） 尾长的方法。我们采用鸟苷/肌苷 （G/I） 拖尾方法，该方法涉及使用酵母聚 （A） 聚合酶在 mRNA 的 3′ 末端酶促添加 G/I 残基。这种修饰可保护 RNA 的 3′ 末端免受酶降解。然后使用通用反义引物对受保护的全长poly（A）尾部进行反转录。随后，使用靶向目标基因的基因特异性寡核苷酸以及用于逆转录的通用序列寡核苷酸进行PCR扩增。
这会产生包含目的基因的poly（A）尾部的PCR产物。由于聚腺苷酸化不是一种均匀的修饰，并且会导致不同长度的尾部，因此PCR产物显示出一系列尺寸，导致琼脂糖凝胶上的涂抹图案。最后，对PCR产物进行高分辨率毛细管凝胶电泳，然后使用poly（A）PCR产物和基因特异性PCR产物的大小进行定量。该技术为分析poly（A）尾长提供了一种简单可靠的工具，使我们能够更深入地了解控制mRNA调控的复杂机制。
Introduction
大多数真核 mRNA 通过经典 poly（A） 聚合酶添加非模板化腺苷，在细胞核的 3′ 末端进行转录后多聚腺苷化。完整的 poly（A） 尾在 mRNA 的整个生命周期中至关重要，因为它对 mRNA 核输出至关重要1，促进与 poly（A） 结合蛋白的相互作用以提高翻译效率2，并赋予抗降解性3。在某些情况下，poly（A） 尾部也可以在细胞质中延伸，这是由非经典 poly（A） 聚合酶4 促进的。在细胞质中，poly （A） 尾长动态变化并影响 mRNA 分子的寿命。已知许多聚合酶和脱烯酰化酶可调节尾长 5,6,7。例如，poly（A）尾巴的缩短与翻译抑制相关，而poly（A）尾巴的延长增强了翻译8,9。
不断积累的基因组研究已经证明了poly（A）尾长在真核生物学各个方面的基本意义。这包括在生殖细胞发育、早期胚胎发育、学习和记忆的神经元突触可塑性以及炎症反应中的作用10。已经开发了许多用于测量poly（A）尾部长度的方法和测定方法。例如，RNase H/oligo（dT）测定利用RNase H在存在或不存在oligo（dT）的情况下研究poly（A）尾长11,12。研究poly（A）尾部的其他方法包括3’末端的PCR扩增，例如cDNA末端poly（A）测试（RACE-PAT）的快速扩增（RACE-PAT）12,13和连接酶介导的poly（A）测试（LM-PAT）14。PAT测定的进一步修改包括ePAT15和sPAT16。酶促 G 尾17,18 或 3′ 端的 G/I 尾是 PAT 测定的其他变体。这些技术的进一步修改包括使用荧光标记引物以及毛细管凝胶电泳进行高分辨率分析，称为高分辨率poly（A）测试（Hire-PAT）19。这些 PCR 驱动的检测可实现快速、高灵敏度的 poly（A） 长度定量。
随着下一代测序的发展，PAL-seq20 和 TAIL-seq21 等高通量测序方法允许在转录组范围内进行多聚腺苷酸化分析。然而，这些方法仅提供 36-51 个核苷酸的短测序读数。因此，FLAM-Seq22 是为全长 mRNA 的全局尾长分析而开发的，并提供长读长。纳米孔技术23 提供 PCR 非依赖性、直接 RNA 或直接 cDNA 测序，用于 poly（A） 尾长估计。然而，这些高通量方法并非没有局限性。它们需要大量的起始材料，价格昂贵且耗时。此外，使用高通量方法分析稀有转录本可能极具挑战性，而当需要分析少量转录本、用于试点实验和其他方法的验证时，基于低通量PCR的方法仍然具有优势。
我们最近证明 Dscam1 mRNA 在果蝇中含有短的 poly（A） 尾巴，这需要使用 G/I 拖尾方法24 将细胞质 poly（A） 结合蛋白与 Dscam1 3’UTR 进行非经典结合。在这里，我们提供了一种简化的程序，用于组织制备和定量来自果蝇神经系统和果蝇 S2 细胞的 poly（A） 长度的 mRNA。
Protocol
Representative Results
Discussion
在该方案中，我们描述了从徘徊的3龄阶段解剖果蝇幼虫大脑的技术以及果蝇S2细胞的样品制备。由于 mRNA 的不稳定性，样本采集需要格外小心。对于幼虫脑夹层，大脑在隔离期间不应受损，也不应长时间保存在溶液中。将解剖时间保持在 8-10 分钟进行一轮解剖是必不可少的。用RNA酶抑制剂补充解剖液也可能是有益的。至于 S2 细胞培养和转染，请在层流罩中执行所有步骤。
…Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项研究得到了美国国家神经疾病和中风研究所R01NS116463 JK 的支持，以及内华达大学里诺分校的细胞和分子成像核心设施，该设施得到了美国国立卫生研究院资助P20GM103650的支持，并用于本研究中报告的研究。
Materials
| 3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS) | Research Product Internation (RPI) | M92020 | |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| Agilent software 2100 expert free download demo | Agilent Technologies | https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-software/2100-expert-software-228259 | |
| Apex 100 bp-Low DNA Ladder | Genesee Scientific | 19-109 | |
| Bioanalyzer | Agilent 2100 Bioanalyzer G2938C | ||
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Research Product Internation (RPI) | D43060 | |
| DNA dye (Gel Loading Dye, Purple (6x) | New England biolabs | B7024S | |
| Drosophila S2 cell line | Drosophila Genomics Resource Center stock #181 | ||
| Drosophila Schneider’s Medium | Thermo Fisher Scientific | 21720024 | |
| Ehidium bromide | Genesee scientific | 20-276 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Forceps Dumont 5 | Fine Science tools | 11254-20 | |
| Nuclease free water | Thermo Fisher Scientific | AM9932 | |
| PBS 10x | Research Product Internation (RPI) | P32200 | |
| Poly(A) Tail-Length Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 764551KT | |
| RiboRuler Low Range RNA Ladder | Thermo Fisher Scientific | SM1833 | |
| RNA Gel Loading Dye (2x) | Thermo Fisher Scientific | R0641 | |
| RNA microprep kit | Zymoresearch | R1050 | |
| RNA miniprep kit | Zymoresearch | R1055 | |
| Scissors-Vannas Spring Scissors – 2.5 mm Cutting Edge | Fine Science tools | 15000-08 | |
| TopVision Agarose Tablets | Thermo Fisher Scientific | R2802 | |
| Tris-Acetate-EDTA (TAE) | Thermo Fisher Scientific | B49 |
Referanslar
- Stewart, M. Polyadenylation and nuclear export of mRNAs. Journal of Biological Chemistry. 294 (9), 2977-2987 (2019).
- Machida, K., et al. Dynamic interaction of poly(A)-binding protein with the ribosome. Scientific Reports. 8 (1), 17435 (2018).
- Eisen, T. J., et al. The dynamics of cytoplasmic mRNA metabolism. Molecular Cell. 77 (4), 786-799 (2020).
- Liudkovska, V., Dziembowski, A. Functions and mechanisms of RNA tailing by metazoan terminal nucleotidyltransferases. Wiley Interdisciplinary Reviews RNA. 12 (2), e1622 (2021).
- Goldstrohm, A. C., Wickens, M. Multifunctional deadenylase complexes diversify mRNA control. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (4), 337-344 (2008).
- Schmidt, M. J., Norbury, C. J. Polyadenylation and beyond: emerging roles for noncanonical poly(A) polymerases. Wiley interdisciplinary reviews RNA. 1 (1), 142-151 (2010).
- Laishram, R. S. Poly(A) polymerase (PAP) diversity in gene expression – Star-PAP vs canonical PAP. FEBS Letters. 588 (14), 2185-2197 (2014).
- Salles, F. J., Lieberfarb, M. E., Wreden, C., Gergen, J. P., Strickland, S. Coordinate initiation of Drosophila development by regulated polyadenylation of maternal messenger RNAs. Science. 266 (5193), 1996-1999 (1994).
- Wreden, C., Verrotti, A. C., Schisa, J. A., Lieberfarb, M. E., Strickland, S. Nanos and pumilio establish embryonic polarity in Drosophila by promoting posterior deadenylation of hunchback mRNA. Development. 124 (15), 3015-3023 (1997).
- Passmore, L. A., Coller, J. Roles of mRNA poly(A) tails in regulation of eukaryotic gene expression. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (2), 93-106 (2021).
- Murray, E. L., Schoenberg, D. R. Assays for determining poly(a) tail length and the polarity of mRNA decay in mammalian cells. Methods in Enzymology. 448, 483-504 (2008).
- Salles, F. J., Strickland, S. Analysis of poly(a) tail lengths by PCR: The PAT assay. Methods in Molecular Biology. 118, 441-448 (1999).
- Salles, F. J., Darrow, A. L., O’Connell, M. L., Strickland, S. Isolation of novel murine maternal mRNAs regulated by cytoplasmic polyadenylation. Genes and Development. 6 (7), 1202-1212 (1992).
- Salles, F. J., Strickland, S. Rapid and sensitive analysis of mRNA polyadenylation states by PCR. Genome Research. 4 (6), 317-321 (1995).
- Janicke, A., Vancuylenberg, J., Boag, P. R., Traven, A., Beilharz, T. H. ePAT: A simple method to tag adenylated RNA to measure poly(a)-tail length and other 3′ RACE applications. RNA. 18 (6), 1289-1295 (2012).
- Minasaki, R., Rudel, D., Eckmann, C. R. Increased sensitivity and accuracy of a single-stranded DNA splint-mediated ligation assay (sPAT) reveals poly(a) tail length dynamics of developmentally regulated mRNAs. RNA Biology. 11 (2), 111-123 (2014).
- Martin, G., Keller, W. Tailing and 3′-end labeling of RNA with yeast poly(A) polymerase and various nucleotides. RNA. 4 (2), 226-230 (1998).
- Kusov, Y. Y., Shatirishvili, G., Dzagurov, G., Verena, G. M. A new G-tailing method for the determination of the poly(a) tail length applied to hepatitis a virus RNA. Nucleic Acids Research. 29 (12), 57 (2001).
- Bazzini, A. A., Lee, M. T., Giraldez, A. J. Ribosome profiling shows that miR-430 reduces translation before causing mRNA decay in zebrafish. Science. 336 (6078), 233-237 (2012).
- Subtelny, A. O., Eichhorn, S. W., Chen, G. R., Sive, H., Bartel, D. P. Poly(a)-tail profiling reveals an embryonic switch in translational control. Nature. 508 (1), 66-71 (2014).
- Chang, H., Lim, J., Ha, M., Kim, V. N. TAIL-seq: Genome-wide determination of poly(a) tail length and 3′ end modifications. Molecular Cell. 53 (6), 1044-1052 (2014).
- Legnini, I., Alles, J., Karaiskos, N., Ayoub, S., Rajewsky, N. FLAM-seq: Full-length mRNA sequencing reveals principles of poly(A) tail length control. Nature Methods. 16 (9), 879-886 (2019).
- Garalde, D. R., et al. Highly parallel direct RNA sequencing on an array of nanopores. Nature Methods. 15 (3), 201-206 (2018).
- Singh, M., Ye, B., Kim, J. H. Dual leucine zipper kinase regulates Dscam expression through a noncanonical function of the cytoplasmic poly(A)-binding protein. Journal of Neuroscience. 42 (31), 6007-6019 (2022).
- Macharia, R. W., Ombura, F. L., Aroko, E. O. Insects’ RNA profiling reveals absence of "hidden break" in 28S ribosomal RNA molecule of onion thrips, Thrips tabaci. Journal of Nucleic Acids. 2015, 965294 (2015).
- Miura, P., Sanfilippo, P., Shenker, S., Lai, E. C. Alternative polyadenylation in the nervous system: to what lengths will 3′ UTR extensions take us. Bioessays. 36 (8), 766-777 (2014).
- Sement, F. M., et al. et al Uridylation prevents 3′ trimming of oligoadenylated mRNAs. Nucleic Acids Research. 41 (14), 7115-7127 (2013).
