冷冻电子显微镜 (cryoEM) 多网格筛选通常是一个繁琐的过程,需要数小时的注意力。该协议显示了如何设置标准 Leginon 集合和 Smart Leginon Autoscreen 以自动执行此过程。该协议可应用于大多数冷冻电镜多孔箔网格。
在过去十年中,冷冻电子显微镜 (cryoEM) 技术的进步使结构生物学家能够常规地将大分子蛋白质复合物解析到接近原子的分辨率。整个冷冻电镜管道的一般工作流程包括在进行高分辨率数据收集之前,在样品制备、冷冻电镜网格制备和样品/网格筛选之间进行迭代。样品/网格制备和筛选之间的迭代通常是研究人员的主要瓶颈,因为每个迭代实验都必须针对样品浓度、缓冲条件、网格材料、网格孔大小、冰厚度和冰中的蛋白质颗粒行为等变量进行优化。此外,一旦这些变量得到令人满意的确定,在相同条件下制备的网格在是否准备好进行数据收集方面差异很大,因此建议在选择用于高分辨率数据收集的最佳网格之前进行额外的筛选。这种样品/网格制备和筛选过程通常会消耗数十个网格和数天的操作人员时间。此外,筛选过程仅限于操作人员/显微镜的可用性和显微镜的可及性。在这里,我们演示了如何使用 Leginon 和 Smart Leginon Autoscreen 来自动化大多数冷冻电镜网格筛选。Autoscreen 结合了机器学习、计算机视觉算法和显微镜处理算法,无需操作员不断手动输入。Autoscreen可以使用自动样本交换盒系统自主加载和成像具有多尺度成像的网格,从而实现整个盒的无人值守网格筛选。因此,与使用以前的方法相比,使用 Autoscreen 筛选 12 个网格的操作员时间可以减少到 ~10 分钟,而使用以前的方法则需要 ~6 小时,这些方法无法解释网格之间的高可变性。该协议首先介绍基本的 Leginon 设置和功能,然后逐步演示从创建模板会话到 12 格自动筛选会话结束的自动筛选功能。
单颗粒冷冻电子显微镜 (cryoEM) 可以对纯化的大分子复合物进行近原子分辨率的结构测定。单个颗粒冷冻电镜实验只需要从具有不同样品和网格条件的更大网格中选择一个或两个精心选择的网格。检查这些网格的显微镜筛选需要以多个放大倍率对每个网格进行成像,以确定哪个网格满足高分辨率数据收集的最关键要求,包括冰厚、用于完整数据收集的足够区域、蛋白质纯度、蛋白质浓度、蛋白质稳定性和最小首选取向问题1.针对这些关键要求进行优化通常涉及显微镜筛选与制备条件(如蛋白质生产、缓冲液选择、潜在去污剂和网格类型 2、3、4 )之间的反馈(图 1)。传统的网格筛选是使用 Leginon5、SerialEM6 和 EPU7 等软件手动或半手动执行的。传统筛选要求显微镜操作员在显微镜前花费数小时来筛选多个网格,这在高分辨率单颗粒工作流程中造成了重大瓶颈,因为操作员需要死记硬背的操作而不是样品/网格优化。
此前,已经介绍了Smart Leginon Autoscreen和底层机器学习软件Ptolemy,并介绍了它们的底层方法和算法以及示例8,9。其他几个软件包能够或致力于全自动多网格筛选10,包括SmartScope11、Smart EPU12和CryoRL13,14。为了解决筛选瓶颈,Smart Legino允许用户首先在模板显微镜会话中设置筛选参数,然后使用该模板会话的参数作为模板,在显微镜自动加载器中筛选完整的网格盒。消除了暗盒筛选过程中的所有手动工作,从而使优化反馈回路能够更高效地进行。
在该协议中,描述了完整的Smart Leginon Autoscreen工作流程,以便阅读器可以独立执行全自动多网格冷冻电镜筛选。对于那些刚接触 Leginon 的人来说,协议的第一部分描述了传统的 Leginon 用法。这些知识由在几台自动加载显微镜上的多年经验组成,然后在随后的协议的Smart Legino部分中建立起来。其他教程视频可以在 https://memc.nysbc.org 上找到。
在此协议中,我们描述了 Smart Leginon Autoscreen 的管道,以及那些刚接触收集软件的人的基本 Leginon 用法。到 2024 年底,单颗粒冷冻电镜有望成为最高效的三维 (3D) 蛋白质结构分离技术17.单颗粒冷冻电镜管道由几个步骤组成,这些步骤不断优化以提高数据质量和通量。 图 2 显示了最常见的步骤(样品制备、网格制备、筛选时间和工作量、高分辨率收集时间、实时处理和完整的后处理)以及可以改进的管道的其他组件(筛选显微镜通道、载物台速度和精度、相机速度和高分辨率显微镜通道)。大多数步骤的结果都会成为先前步骤的反馈循环( 图 2 中的蓝色箭头),使整个管道高度相互依赖。 图 2 中的每个步骤都涂有颜色,以近似该步骤相对于其他步骤的瓶颈程度。智能 Leginon Autoscreen 将筛选 12 个网格的时间和精力从 6 小时缩短到不到 10 分钟,从而缓解了瓶颈,并允许更快速地反馈样品/网格制备(图 3)。
《议定书》中有几个关键步骤,如 图1所示。至关重要的是,用于创建模板会话的网格必须代表要筛选的其余网格。重要的是,Leginon 会记住整个设置过程中的所有设置,以创建模板会话( 图 1 中的蓝色步骤),这允许每次更快地设置循环模板会话。创建模板会话时,最关键的步骤是设置所有放大倍率的定位,以便参数和阈值反映要筛选的网格的预期变化。各种“测试”按钮可提高此设置过程的效率。在 Autoscreen 会话期间,监控 Appion 中的前几个网格以快速检测任何问题并尽快在 Leginon 内部修复它们至关重要。
SEMC 的典型工作流程是将 Autoscreen 数据输入到 CryoSPARC Live18 中,并使用这些附加信息将反馈回路告知样品/网格制备。在研究人员和操作员密集的冷冻电镜优化日期间,有关样品和网格条件的信息被反馈到样品和网格制备中,而Autoscreen仍在筛选网格。这允许每周冻结和筛选数十个网格8.
Smart Leginon Autoscreen 适用于在 SEMC 观察到的大多数 (80%-90%) 有孔的网格和条件。其余 10%-20% 的网格包括那些有时效果不佳的网格 – 孔和基板之间对比度差异最小的网格;具有较小孔和间距的网格(例如,0.6/0.8) – 以及通常不切实际地跨多个网格进行定位的网格 – Spotiton/Chameleon19,20 网格,由整个网格中的样本条纹组成;花边网格。请注意,带有 Autoscreen 的倾斜网格集合正在开发中,但尚未推出。可以修改协议以使用 Spotiton/Chameleon 网格,方法是首先手动成像条纹区域以确定窄参数阈值,然后在步骤 2.1.7.4 中尝试将更大和更小的方块分别组合在一起,然后从带有冰的组中选择目标。此修改的目标是让 Smart Leginon 将空方块和非空方块分成两组。如果找到参数,它们可能无法很好地扩展到要筛选的其余网格。也可以修改协议以使用花边网格,方法是删除步骤 2.1.9.1 中的hl_finding.sh脚本,并根据需要配置参数以针对较亮/较暗的区域。根据冰的厚度和网格材料,这种修改的成功率可能因网格而异。
在自动屏幕会话期间进行故障排除是可能的,有时是适当的。在自动采集过程中,可以更改预设(例如,散焦)和瞄准参数(例如,孔瞄准阈值)。在收集自动屏幕会话时,无法取消网格会话,因为它将终止 autoscreen.py。但是,“目标”节点中的“中止”按钮可用于跳过网格的任何部分或整个网格。有时,autoscreen.py 可能会使用过多的内存并冻结,提供两个选项:“强制退出”或“等待”。如果选择“强制退出”,则整个脚本将终止,要求用户重新运行脚本以应用于其余网格进行筛选。如果选择“等待”,脚本将继续,并且可以更改设置以防止将来冻结,例如,关闭“曝光”节点中的图像显示、减小图集中的像素大小或运行内存清除脚本。如果程序在未提供这两个选项的情况下冻结,则内存错误可能无法自行解决,从而导致采集暂停。在这种情况下,“强制退出”选项可能很有用。
SEMC经常使用Smart Leginon Autoscreen。随着单颗粒冷冻电镜管道中的瓶颈不断减少,冷冻电镜的采用将继续增加,以帮助回答生物学问题。该协议是朝着优化整个管道的方向迈出的一步,它为显著减少反馈循环提供了清晰的路径。
The authors have nothing to disclose.
其中一些工作是在纽约结构生物学中心的西蒙斯电子显微镜中心进行的,得到了西蒙斯基金会(SF349247)、美国国立卫生研究院(U24 GM129539)和纽约州议会的支持。
Glacios cryoTEM | Thermo Fisher Scientific | GLACIOSTEM | FEG, 200 keV, Falcon 3EC camera |
Krios cryoTEM | Thermo Fisher Scientific | KRIOSG4TEM | XFEG, 300 keV, Gatan BioQuantum energy filter, Gatan K3 camera |
Leginon | Simons Electron Microscopy Center | http://leginon.org | |
Ptolemy | Simons Machine Learning Center | https://github.com/SMLC-NYSBC/ptolemy |