使用Smart Legino的冷冻电子显微镜跨多个网格进行自动化筛选

为了遵循 图2所示的协议，Leginon 3.6+需要安装在显微镜计算机和额外的Linux工作站上，而Ptolemy需要安装在Linux工作站上。该协议是使用赛默飞世尔科技 （TFS） Glacios 和 Krios 显微镜开发数年的。该协议假定读者已经配置了 Leginon、Appion15、相关数据库、显微镜校准，在显微镜上执行了直接对准，并设置了两个 Leginon 应用程序：一个用于标准单颗粒采集，另一个用于使用 Ptolemy 进行单颗粒采集。有关设置 Leginon 的信息，请访问：https://emg.nysbc.org/redmine/projects/leginon/wiki/Leginon_Manual。有关在 Leginon 中设置托勒密的信息，请访问：https://emg.nysbc.org/redmine/projects/leginon/wiki/Multi-grid_autoscreening。从 http://leginon.org 下载 Legino，从 https://github.com/SMLC-NYSBC/ptolemy 下载 Ptolemy。Leginon 根据 Apache 许可证 2.0 版获得许可，而 Ptolemy 根据 CC BY-NC 4.0 获得许可。 1. Leginon 的使用 启动 Leginon在显微镜 Windows 计算机上，关闭所有 Leginon 客户端，然后重新打开它。在 Linux 工作站中，打开终端窗口，然后键入 start-leginon.py 或系统的相应 别名 来启动 Leginon。 在新的 Leginon 设置 窗口中，选择创建 新会话 ，然后单击 下一步。 从下拉列表中选择项目，然后单击 下一步。 保持 “名称 ”不变，为显微镜设置选择正确的支架，然后单击 “下一步”。 对于描述，请输入显微镜名称、网格/样品描述和实验描述等相关信息，然后单击 下一步。 对于映像目录，请确保选择了适当的文件系统，并且完整路径适合保存映像，然后单击 下一步。 在 “连接到客户端”下，单击 “编辑”。在下拉菜单中，选择应连接的所有计算机，然后单击每台计算机的“+”按钮，然后单击 “确定 ”和 “下一步”。 输入正确的 C2 光圈大小，然后单击 下一步。此值可在 TFS TUI 软件的“ 光圈 ”选项卡中找到。 Leginon 接口从工具栏中选择 “应用程序 ”，然后单击 “运行”。 从下拉菜单中选择适当的应用程序（如有必要，单击 “全部显示 ”）。将 main 设置为 Leginon 计算机，将 示波器和相机 设置为相应的计算机，然后单击 运行。Leginon 主窗口的左侧将填充节点。注意：左侧面板显示所有 Leginon 节点。绿色相机图标节点是将要保存的图像： 网格、正方形、孔 洞和 曝光。带有目标符号的节点是低倍率图像，用于定位高倍率图像。紫色相机节点是经过编程以查找常心 z 高度和常心焦点的节点。此外，还有一些节点可以对齐零损耗峰值、监控缓冲周期、监控液氮填充、收集增益校正图像、计算冰厚 （IceT） 以及使用载物台和图像偏移通过不同的放大倍率导航网格。 预设管理器单击 Presets_Manager节点。在该节点中，单击底部图标以 导入预设 ，或单击该图标上方的图标 以根据显微镜的当前状态创建新预设。 如果单击底部图标，将打开 “导入预设 ”窗口。选择正确的 TEM 和数码相机，然后单击 查找 并选择具有所需预设的最新会话。突出显示所有所需的预设，然后单击 “导入”，然后单击 “完成”。注意：预设管理器节点现在应列出所有导入和创建的预设。建议为多种放大倍率和对焦设置预设，包括 gr：网格放大倍率、sq：方形放大倍率、hln：孔放大倍率、fan：自动对焦、fcn：中央对焦、enn：曝光放大倍率（尾随“n”是指纳米探针）。每个放大倍率的典型预设参数如 表1、表2和 表3所示。请注意，该协议对Glacios使用70μm的C2孔径，对于带有Selectris X和Falcon 4i的Krios使用50μm，对于使用带有K3的BioQuantum的Krios使用100μm。 导航和偏心高度要熟悉通过 Leginon 控制显微镜并设置网格的 z 高度，请转到 导航节点，选择顶部的 gr 预设，然后单击右侧的 红色箭头 将预设设置发送到显微镜。显微镜应在1-2秒后更新。更新后，单击右侧 的相机按钮 以获取图像。 使用光标工具，选择一个网格方块作为舞台移动位置。单击 sq 放大倍率，然后单击红色 箭头 发送到显微镜，然后单击 相机按钮 以获取图像。 转到 Z_Focus节点 ，然后单击按钮中间附近顶部的 “模拟目标 ”按钮。在收集图像以进行载物台倾斜对焦时，切换到 相关视图 并观察峰值以确保它位于相关图像的一角。对焦完成后，确保载物台设置为网格的 z 高度。 昏迷矫正注意：本小节假定已执行直接对齐，并且尚未执行彗差校正。导航到产生透明 Thon 环（如碳基板）的网格区域。注意：如果要在金网格上进行收集，则可以使用交叉光栅。 在 Beam_Tilt_Image设置中，确保“ 预设顺序 ”仅包含具有四个倾斜方向的 fcn ，角度为 0.005 弧度。 单击 “模拟目标 ”以创建 Zemlin 画面。单击主窗口左侧的 “Tableau ”以查看 Tableau。 通过比较左右傅里叶变换以及顶部和底部傅里叶变换相互比较来校正彗发。如果图像对不相同，请先单击图像调整右侧的光标图标，然后在差异方向上单击 Tableau 图像中略微偏离中心的图标，并等待收集一组新的傅里叶变换。重复上述步骤，直到傅里叶变换相同。注意：每次 Tableau 单击都需要几秒钟才能完成，在此期间不应进行其他单击。 获得参考注意：如果相机具有自动硬件参考，请跳过此部分。在 “导航”节点中，发送低放大倍率预设（如 gr），然后导航到光束路径没有障碍的区域。 通过使用 sq 或 hln 预设拍摄中等放大倍率的图像，确认载物台位置位于未被光束路径阻挡的位置。 将高倍率 enn 预设发送到显微镜。 在 “校正”节点设置中，选择正确的 “仪器 ”信息，并设置 “相机配置 ”以匹配采集设置。 通过关闭显微镜上的柱阀来收集深色参考图像，然后在“校正”节点中，从顶部的下拉菜单中选择“暗”和“双通道”，然后单击右侧的“采集相机”按钮。 完成后，从下拉菜单中选择 Bright ，然后单击 Acquire。Leginon 将自动打开柱阀。 通过从下拉菜单中选择 “已校正 ”，单击“ 获取”并观察生成的图像，检查增益是否已正确收集。 冰厚参考图像如果显微镜具有能量过滤器，则在 IceT 节点设置中，选中收集冰厚图像，输入 395 作为 平均自由程，然后填写设置的其余值。 如果显微镜没有能量过滤器，则在 导航节点中，将 enn 预设发送到显微镜 ，然后单击获取。记下左侧 的平均像素值 。在 IceT 节点设置中，选中从孔径限制散射计算冰厚，输入 1055 作为 ALS 系数 和测量的平均像素值。注意：如前所述，TFS Krios 和 Glacios 分别确定了值 395 和1055，并且可能需要针对不同的显微镜配置重新校准。 图像剂量校准在 Preset_Manager中，选择enn预设，然后单击 相机按钮（获取所选预设的剂量图像）。检查底部的测量剂量。如果它接近预期值（通常在 30 到 70 之间），请单击 “是”。 预设对齐方式在 Preset_Manager中，检查所有高放大倍率预设（enn、 fcn 和 扇形），以确保图像偏移和光束偏移为 0、0。 在显微镜计算机上， 导航 到碳区域。 在 Leginon 计算机上的 “导航”节点中， 获取具有 gr 预设的图像。 找到感兴趣的对象，然后使用 光标工具转到该位置。 使用 hln 预设获取图像，并使用光标工具将该感兴趣对象的独特部分重新定位到中心。 使用 enn 预设获取图像，并使用光标工具将其重新定位到感兴趣对象的同一唯一部分。 从下拉菜单中选择 图像偏移 ，然后使用 hln 预设 获取 图像。使用 光标工具重新定位到感兴趣对象的同一唯一部分。 在Presets_Manager中，选择 hln 预设，单击 settings 按钮，然后通过单击图像偏移值旁边的左侧绿色箭头从导航导入图像偏移。 对 sq 和 gr 预设重复步骤 2.9.7 和 2.9.8。 网格图集在显微镜计算机上，关闭柱阀并缩回物镜孔径。转到Grid_Targeting节点。在设置中，更改网格的标签。选择地图集的所需半径（最大半径为 0.0009 m）。单击“确定”。然后单击顶部的计算地图集计算器按钮，然后单击绿色的播放按钮（“提交目标”）。 在 Square_Targeting节点中，将收集网格图像并将其拼接在一起以形成图集。使用 下拉菜单 放大和缩小并调整对比度和亮度。使用 滚动条 在整个网格中移动。 收集图集后，如果需要， 请插入 物镜孔径。 如果显微镜有能量滤光片，请在虚线正方形的中心选择 一个参考目标 ，按 下播放按钮，然后继续以下小节中的ZLP对齐。否则，请跳过 ZLP 对齐步骤。 ZLP 对齐在Align_ZLP节点设置中，选择阶段位置n 移动参考目标，选择预设管理器作为移动器。取消选择旁路调节器，然后按 OK。注意：现在应配置ZLP对准，以便显微镜定期移动到参考目标并执行相机的ZLP对准程序。30 分钟和 60 分钟的 ZLP 重新校准时间通常分别适用于 Gatan BioQuantum 和 TFS Selectris X 能量过滤器。这些值因能量过滤器条件而异，包括一致的湿度、一致的温度、电磁场隔离和振动隔离。 孔模板定位设置在 Square_Targeting节点中，选择多个 采集 目标，然后按 播放。 在Hole_Targeting节点设置中，确保选中允许用户验证所选目标和排队目标。另外，请选中 跳过自动孔查找器 现在。单击“应用”，然后单击“确定”。 在主窗口中，使用 Ctrl-Shift 右键单击 以删除所有目标。选择 采集光标 并放置目标。选择 焦点光标 ，并在采集目标之间放置一个焦点目标。点击 播放。 对于下一张 Hole_Targeting 图像，请取消选中设置中的 跳过自动孔查找器 ，然后单击 应用 和 确定。通过 Ctrl-Shift 右键单击删除自动目标。 选择 标尺工具 并测量孔上的直径。在 “模板设置”中，将 “最终模板直径 ”更改为测量的孔直径。不要更改 原始模板直径。单击 “测试”。如果每个孔的中心没有明亮的峰，则增加 最终模板直径。完成后，单击 “确定”。 在 阈值设置中，为 A 选择一个值，该值在单击 “测试 ”时单独分割孔。满意时单击 “确定 ”。 在“ Blob”设置中，输入值，然后单击 “测试”。最大 blob 值为 1，因此只显示一个 Blob。单击 “确定”。 在 格子设置中，使用 标尺工具 测量两个孔之间的距离（中心到中心）。在 “间距 ”中输入值，然后单击 “测试”。一个斑点将变成一个格点。单击 “确定”。 转到 采集设置，然后使用冰厚阈值和 测试定位按钮优化采集目标。通过将鼠标悬停在晶格点上来获取冰厚度信息。 如果采集目标不令人满意，请使用 标尺工具 测量从晶格点到采集目标所需位置的距离和角度。删除先前 的“采集目标模板 ”点。单击 “自动填充”，输入 4 作为目标数量，然后将半径和角度更改为测量值。单击 “确定”。 选中在模板卷积采集目标上应用冰厚阈值。 对晶格点和冰厚阈值感到满意后，单击 “提交目标 ”按钮。 根据需要对所选的每个方块重复上述任何步骤。提交所有方形目标后，使用 “提交排队目标”按钮 提交整个队列。 Leginon 将开始对每组目标进行聚焦和成像。在 Z_Focus节点中，确保正确找到偏心高度。 曝光模板定位设置在 “曝光”目标节点中，将出现孔放大图像。使用 Ctrl-Shift 右键单击 以删除自动目标。 用 尺子工具测量孔的直径。在 模板设置中，将直径输入到 最终模板直径 中，然后单击 测试。现在，每个孔的中心都应该有一个峰。如有必要，调整 直径 值。 在 阈值设置中，调整 A 值，直到二值化测试图像仅显示孔所在的白色区域。 在 “Blob”设置中，单击 “测试”。每个分段孔应显示一个斑点。如果需要，增加 边框 以从图像边缘删除 Blob。 在 “莱迪思”设置中，单击 “测试”。调整参数，直到所有 blob 都变成格点。单击 “确定”。 单击 标尺工具 并测量两个晶格点之间的距离。在 “格子”设置中，将 “间距” 更改为该距离。 将鼠标悬停在每个晶格点上可查看平均强度、平均厚度、标准差强度和标准差厚度。记下每个晶格点的强度，并使用它们在 采集设置中设置所需的冰厚参数。 用 尺子工具测量从一个格子点到 4 个孔中心的距离和角度。在 采集设置中，删除当前对焦目标。单击 “自动填充”（Autofill），然后将半径和角度更改为测量值。单击 “测试定位”，单击 “确定”，然后单击 “提交目标”。注意：Leginon 将找到偏心焦点（对焦节点）并收集曝光，这些曝光将出现在 曝光节点中。 对所有目标进行成像后，转到 Exposure_Targeting节点 以查看下一个孔图像。在 设置中，取消选中允许用户验证所选目标。此外，取消选中 Queue up targets 和 Skip automatic hole finder。单击 “确定 ”，然后单击 “提交目标”。注意：Leginon 将根据上述配置的设置自动收集图像。查看 Appion 中的图像和元数据。 可以在自动收集期间进行更改。例如，通过编辑Preset_Manager中的 enn 预设，随时更改集合散焦范围。 如果需要停止收集，请通过单击“孔”（Hole） 和“暴露”（Exposure） 节点中的“ 中止”（Abort ） 和“ 中止队列”（Abort Queue ） 按钮来结束队列。 收集完成后，转到 “应用程序 ”并单击 “终止”，然后转到 “文件 ”并单击 “退出”。 2. Smart Leginon 自动屏幕使用 创建智能 Leginon 模板会话按照第 1 节中的说明启动 Leginon。 转到 “应用程序 ”，然后单击 “运行”。在“ 运行应用程序 ”窗口中，选择“ Ptolemy 应用程序 ”（如有必要，选择 “全部显示 ”）。 将 main 设置为 Leginon 计算机，将 示波器和相机 设置为相应的计算机。 在 Preset_Manager中，按照步骤 1.2.3 中的说明 导入 预设。 配置节点设置。在Square_Targeting节点设置中，确保选中“按最短路径对目标进行排序”和“启用自动定位”（补充图 1A）。 在 Square 节点设置中，确保选中 Wait for node to processing the image （等待节点处理图像）。将 Square 预设添加到下拉菜单右侧的列表中（如果尚不存在）。在高级设置中，选中在成像时设置这些光圈，并确保两个光圈的值正确（补充图1B）。 在 Hole_Targeting节点设置中，选中允许用户验证所选目标。取消选中 Queue up targets 和 Skip automatic hole finder（补充图 2A）。 在 “孔节点”设置中， 选中“等待节点处理图像”，并且“孔 ”预设位于右侧列表中。在 高级设置中，选中成像时设置这些光圈 ，并确保两个光圈的值正确（补充图2B）。 在 Exposure_Targeting节点设置中，选中 允许用户验证所选目标。 取消选中 Train up targets 和 Skip automatic hole finder （补充图 3A）。 在“曝光”节点设置中，确保未选中“等待节点处理图像”，右侧列出了“曝光”预设，在“高级设置”中，选中“在成像时设置这些光圈”，并确保两个光圈的值正确（补充图3B）。 在对焦节点设置中，确保未选中“等待节点处理图像”，右侧列出了“自动对焦”预设，并将“所需的自动对焦精度”设置为 4 x 10-6 m（补充图 4A）。 在 对焦节点对焦序列 （设置按钮旁边）中，仅启用两个 光束倾斜自动对焦 步骤（补充图 4B，C）。 在Z_Focus节点设置中，确保未选中“等待节点处理图像”，右侧列出了“孔”预设，并且“所需的自动对焦精度”为5 x 10-5 m（补充图5A）。 在 Z_Focus节点的“对焦序列 ”中，仅启用两个 低放大倍率的载物台倾斜 步骤（补充图5B，C）。 按照步骤 1.2.4 中的说明确定网格的 z 高度。 按照步骤 1.2.10 中的说明收集图集。 设置方形查找器参数。收集地图集后，托勒密将在 Square_Targeting节点中定位正方形。每个方块将显示一个蓝色圆圈，称为斑点。当鼠标悬停在每个斑点上时，Leginon 将报告托勒密计算的大小。记下最大和最小的 Blob。 在 “阈值”设置中，更改最小和最大 筛选范围 ，以包括所需的方块并排除不需要的方块。 单击顶部工具栏中的 “查找方块”按钮 。调整 滤镜范围 ，直到 “查找方块 ”目标正确。 在 采集设置中，选择“ 最大目标数 ”和 “要采样的目标组数”的值。这些参数将定义目标方块和方块组的数量。 对参数感到满意后，单击 “播放 ”按钮。安装后的图集示例如 补充图 6 所示。 设置孔查找器参数。在 Hole_Targeting节点中，使用 标尺工具 测量孔的直径。 在 模板设置中，将直径输入到 最终模板直径 中，然后单击 测试。调整直径，直到所有孔的中心都有明亮的白色峰值。 在 “阈值设置”中，单击 “测试”。调整 A 值，直到二值化图像仅显示孔所在的白色区域。 在 Blob 设置中，选择使用标尺确定与边缘的最小距离并输入该值来排除 边框 目标。可以按 Blob 的大小、圆度和所需数量进行筛选。将鼠标悬停在 blob 上以显示其值。单击“ 测试 ”以检查当前值。 在 格子设置中，输入孔的半径和孔之间的间距（使用测量工具），然后单击 42 按钮 测量真空区域（空孔或破损的支撑膜）的 参考强度 值。 在 采集设置中， 选中使用采集目标的子集 ，并将 “样本最大值 ”设置为较小的数字，例如 2。设置各种冰厚平均值和标准差（通过将鼠标悬停在目标上来测量这些值）。点击 测试定位条件 ，根据上述值随机选择目标。 单击 播放 对所有设置感到满意时的 按钮 。Leginon 将执行 第 Z_Focus 阶段并收集第一个目标。安装后的示例图像如 补充图 7 所示。 设置曝光定位参数。在 Hole 设置中，将 Shell 脚本 设置为 Ptolemy 安装中的 hl_finding.sh 脚本路径。将要接受的最低分数设置为 ≤0。输入孔的半径（使用测量工具），然后单击 42 按钮 测量真空区域（空孔或破损的支撑膜）的 参考强度 值。单击 “测试 ”（Test） 以查找孔的晶格。 在 采集设置中，选中使用采集目标的子集 ，并将 “样品最大值 ”设置为较小的数字（如 4），以收集用于筛选的孔子集。设置各种冰厚平均值和标准差（通过将鼠标悬停在目标上来测量这些值）。 单击 播放 对所有设置感到满意时的 按钮 。Leginon 将执行偏心对焦并收集高倍率图像，这些图像可以在 曝光 节点中看到。安装后的示例图像如 补充图 8 所示。 检查下一张Exposure_Targeting图，看看上面的设置是否仍然足够。满足后，在“曝光定位”和“孔定位”设置中取消选中允许用户验证所选目标。注意：当前网格的筛选现在应该在无人值守的情况下运行。此会话将用作所有网格的模板会话。 网格完成筛选后，单击 “文件”>“退出 ”以关闭 Leginon。 设置 Smart Leginon 自动屏幕在终端窗口中，执行 Smart Leginon 的 autoscreen.py。 选择 gui，输入要筛选的网格插槽的逗号分隔列表，为工作流输入完整，输入模板会话名称以基于新会话（可以在 Appion imageviewer 中找到），然后输入模板会话的 z 高度值（补充图 9）。 将打开一个 GUI，允许输入每个网格的会话名称并选择它们各自的项目关联（补充图 10）。注意：Smart Leginon Autoscreen 现在将使用模板会话设置自动筛选每个网格并在无人值守的网格之间切换。 在Leginon，Appion和显微镜计算机的收集过程中跟随，或者让显微镜完全无人看管。注意：筛选完所有网格后，Smart Leginon 将关闭显微镜上的柱阀。