Primordial Germ Cell Cryopreservation and Revival of Drosophila Strains(초파리 균주의 원시 생식세포 냉동 보존 및 부활)

1. 장비 준비 Micromanipulator 시스템: Micromanipulator 시스템을 조립하여 세포를 수집하고 이식합니다(그림 1A). PGC 수집 유리 슬라이드(그림 2A)헵탄 접착제를 준비하려면 약 30cm 길이의 양면 테이프를 자르고 기술(일반) 등급 헵탄 용액 7mL에 밤새 담그십시오. 배아 정렬을 위해 유리 슬라이드 뒷면에 두 개의 평행한 기준선을 그립니다. 파스퇴르 피펫을 사용하여 유리 슬라이드(선이 없는 쪽)에 위의 헵탄 접착제 방울을 펴 바릅니다. 슬라이드 표면이 하얗게 될 때까지 자연 건조시킵니다. 헵탄 접착제 방울을 넣고 펴 바르는 것을 반복하고 슬라이드를 다시 말리십시오.알림: 접착제는 액체 용액이 평평한 표면에 퍼지는 것을 방지하고 수용액을 바늘에 더 쉽게 로드할 수 있도록 합니다. 배아 풀 프레임을 만들려면 전기 테이프와 같은 0.2mm 두께의 표준 비닐 테이프를 도마에 3겹 붙입니다. 테이프를 1.5cm 너비의 직사각형으로 자릅니다. 그런 다음 세 겹의 테이프를 모두 잘라내어 2-3mm 프레임을 남깁니다.알림: 배아 풀 프레임은 배아를 정렬한 후 부착되어 배아를 위한 풀을 형성합니다. 이식 바늘참고: 이 연구 당시 시중에서 판매되는 모든 바늘은 PGC 동결 보존을 하기에는 너무 좁거나 너무 넓었습니다.유리 모세관과 풀러를 사용하여 바늘을 만드십시오. 히터 레벨이 85.0-98.4, 마그넷 메인 레벨이 57.8, 마그넷 서브 레벨이 45.0인 NARISHIGE PN-31 풀러를 사용합니다. 대략 벽 두께가 1μm이고 팁 길이가 약 200μm이고 내경이 10-12μm인 바늘을 만들려면 다음 3단계 공정으로 바늘 끝을 연마합니다(그림 3). 먼저 팁의 내경이 10-12μm가 될 때까지 780rpm의 속도로 바늘 끝을 30° 각도로 연마합니다. 이 첫 번째 연삭 단계는 약 1시간이 걸립니다.알림: 바늘 끝이 부러지지 않도록 하려면 먼저 숫돌을 돌린 다음 바늘을 숫돌 위로 부드럽게 아래로 움직입니다. 바늘 상단에 선을 그려 원하는 각도를 추적합니다. 바늘을 시계 반대 방향으로 90° 돌리고 180rpm의 속도로 다시 연마합니다. 약 5분 정도 소요됩니다. 바늘을 시계 방향으로 45° 돌리고 180rpm의 속도로 1초 동안 연마합니다. 크롬산 혼합물(주의: 독성) 한 방울이 있는 수집 유리 슬라이드를 현미경 s에 놓습니다.tag이자형. 슬라이드 표면을 기준으로 1°-10° 각도로 바늘을 모세관 홀더(그림 13D)에 부착하고 바늘을 조심스럽게 아래로 이동한 다음 팁을 크롬산 혼합물에 담그십시오. 플런저를 당기고 밀면서(그림 1B) 바늘에서 용액을 기계적으로 여러 번 로드하고 배출하여 바늘의 유리 파편을 제거합니다. 외벽도 반드시 청소하십시오. 바늘의 안쪽과 바깥쪽을 증류수로 두 번 씻어 크롬산을 완전히 제거합니다. 2. PGC의 수집 및 동결 보존 배아 채취관심 있는 기증자 균주의 적절한 수의 파리(배아 수집 컵의 경우 각 성별에 대해 약 450마리)를 배아 수집 플레이트(그림 1E)가 있는 배아 수집 컵에 옮기고 25°C에서 배양합니다. 우리는 보통 실온(23-25°C)의 덜 붐비는 조건에서 사육되는 생후 3-5일 된 부모 파리를 사용합니다. 30분 동안 두 번의 사전 수집을 수행하고 낳은 알은 버립니다. 암컷은 난관에서 발달하는 수정란을 유지할 수 있기 때문에 이 단계는 2.1.3단계에서 알을 낳는 것을 동기화하는 데 필요합니다(그림 4). 두 번의 사전 채취 후 50분 동안 배아를 채취한 다음 채취한 배아를 25°C의 가습 챔버에서 배양하여 배아가 배배엽 단계(초기 단계 517)로 발달할 수 있도록 합니다. 배양 시간은 일반적으로 100분이지만 균주에 따라 최대 120분까지 연장할 수 있습니다(그림 4).알림: 가습 챔버는 플라스틱 상자 바닥에 축축한 종이 타월을 놓고 사용 전에 물 미스트를 뿌려 만듭니다. 초기 5기 배아에서는 PGC 형성이 완료되지만 체세포 형성은 완료되지 않습니다. 배아의 정확한 단계는 2.4 단계에서 복합 현미경으로 결정됩니다. 탈코리오네이션 배아스테인리스 스틸 메쉬 스트레이너(150메쉬, 109μm 개구부, 60μm 와이어 직경; 그림 1F). 겸자를 사용하여 배아 수집 플레이트에서 배아를 수집하여 물방울에 넣습니다. 티슈 페이퍼를 아래에서 여과기에 대고 눌러 물을 흡수합니다. 신선한 5%(Cl) 차아염소산나트륨 용액 방울을 배아에 추가하고 10초 동안 여과기를 계속 두드립니다. 배아에 증류수를 직접 뿌려 씻고 티슈 페이퍼를 아래에서 여과기에 대고 눌러 물을 흡수합니다. 이 단계를 3번 반복합니다. 탈융모 배아 정렬실체 현미경에서 겸자를 사용하여 배아를 이식합니다. 탈코리온화된 배아를 두 개의 기준선을 따라 PGC-수집 유리 슬라이드에서 두 줄로 정렬합니다(그림 2A). 배아는 앞쪽이 오른쪽(조작되는 쪽)과 복쪽이 위로 향하도록 되어 있습니다.참고: 이 단계는 20분 안에 완료되어야 하며, 그 동안 일반적으로 약 40개의 배아를 정렬합니다. PGC-collection 유리 슬라이드의 배아 주위에 배아 풀 프레임을 부착합니다. 1μL의 CPA 용액(20% 에틸렌 글리콜 및 1M 자당 함유, 1x EBR, 1x EBR: 130mM NaCl, 5mM KCl, 2mM CaCl2 및 pH 6.9에서 10mM Hepes)을 프레임으로 둘러싸인 영역의 두 개별 지점에 떨어뜨리고 배아가 건조되는 것을 방지하기 위해 풀에 실리콘 오일을 채웁니다(그림 2A).참고 : CPA 용액을 제조하려면 10 x EBR 용액 3mL를 포함하는 증류 된 H2O 약 20mL에 자당 10.26g을 완전히 용해시킵니다. 에틸렌 글리콜 6mL를 첨가한 후 증류된H2O를 최대 30mL까지 첨가한다. 완전히 혼합한 후 0.22mm 일회용 멤브레인을 통해 용액을 여과합니다. PGC 수집2.3.2단계의 PGC 수집 유리 슬라이드를 마이크로 매니퓰레이터 시스템이 장착된 현미경의 스테이지에 놓습니다. 바늘을 모세관 홀더에 부착하고 왼쪽 줄의 첫 번째 배아와 바늘 끝을 동일한 초점면으로 가져옵니다. 실리콘 오일을 바늘에 2-3초 동안 넣습니다. 왼쪽 줄에 있는 배아에서 PGC 채취를 시작합니다. 20x 대물 렌즈를 사용하여 바늘 끝을 배아의 앞쪽 끝 표면으로 부드럽게 이동하고 바늘을 움직이지 않고 현미경 스테이지를 움직여 배아를 뒤쪽 끝 쪽으로 관통합니다. 바늘 끝이 뒤쪽 끝에 도달하면 바늘을 약간 집어넣고 체세포층 바로 안쪽에 있는 바늘의 노른자를 완전히 배출합니다. 바늘의 압력을 일정하게 유지하면서 바늘 끝을 후극 바로 안쪽의 PGC로 이동하고 부드럽게, 그러나 많은 시간을 들이지 않고 PGC를 로드합니다. 바늘을 배아에서 빠르게 빼내고 바늘에서 난황 및 기타 오염 물질을 실리콘 오일 풀로 배출하여 PGC를 바늘에 유지합니다. 그런 다음 수영장에서 깨끗한 실리콘 오일을 넣으십시오. 왼쪽 줄의 다른 배아에 대해 2.4.2-2.4.5단계를 반복합니다. 새로운 배아에서 PGC를 채취하기 전에, 2.4.5 단계에서 로딩된 실리콘 오일을 체세포층 내부에 가능한 한 많이 증착시키면서 로드된 PGC를 바늘에 보관합니다. 이렇게 하면 새로 로드된 PGC가 이전에 수집된 PGC에 인접해 있으며 PGC 사이에 중간 물질이 없습니다. 왼쪽 줄의 배아에서 PGC 채취를 완료한 후 PGC를 노른자 및 기타 오염 물질에서 최대한 분리합니다. 이를 위해 바늘에 있는 모든 PGC를 배아 표면에 증착하고 다른 이웃 배아의 난황 또는 기타 오염 물질을 제거합니다. 다음으로, 오른쪽 줄의 배아에서 PGC를 수집합니다. 오른쪽 행과 왼쪽 행에서 수집된 PGC를 결합합니다. PGC에 동결보호제(CPA) 적용한 방울에 CPA로 바늘을 씻은 후, 다른 방울에 새 CPA를 바늘에 넣고 배아에 침착된 PGC에 CPA를 추가합니다. CPA의 거래량은 PGC의 거래량과 동일해야 합니다. CPA를 추가한 후 1-2초 후에 PGC 클러스터에서 가능한 한 많은 CPA를 제거합니다. PGC는 CPA 첨가 직후 약간 줄어들고 정사각형 모양이 됩니다. 바늘을 비운 다음 실리콘 오일을 5초 이상 로드합니다. 수집된 모든 PGC를 로드한 다음 실리콘 오일을 다시 한 번 5초 이상 로드합니다. PGC는 이제 두 층의 실리콘 오일 사이에 끼워져 있습니다(그림 2B).알림: 가능한 한 많은 노른자, CPA 및 기타 오염 물질을 제거하는 것이 중요합니다. 동결 보존 PGC3방향 마개(그림 1C)를 연 다음 미세 조작기에서 바늘을 분리합니다. 부드러운 티슈 페이퍼로 바늘 표면의 기름을 닦아냅니다. 티슈로 바늘 끝을 직접 만지지 마십시오. 바늘을 바늘 홀더에 부착하고 비닐 테이프를 사용하여 바닥의 제자리에 고정합니다(그림 1H). 홀더 튜브에 라벨을 부착합니다. 바늘이 아래쪽을 향하도록 홀더를 액체 질소에 담가 급속 동결합니다. 액체가 랙에서 거품을 멈출 때까지 홀더를 놓지 마십시오. 홀더를 증기상 영역이 아닌 액상 영역의 액체 질소 저장 탱크에 보관하십시오. 3. PGC 해동 및 이식 agametic 숙주 파리의 배아 수집, 탈코리오네이션 및 정렬2단계에 따라 agametic 숙주 파리에서 배아를 수집하고 탈코리오네이트합니다. 5단계 무생식 숙주 배아를 이식 유리 슬라이드에 맞춥니다. 그러나 이번에는 후방을 오른쪽(조작할 쪽)으로, 복부를 위쪽으로 향하게 합니다(그림 5). 20분 안에 약 30개의 배아를 두 줄로 정렬합니다. 배아를 정렬하는 동안 실내 습도에 필요한 경우 가습기를 2-10분 동안 작동하십시오(표 1). 이상적인 습도는 30%에서 40%이지만 열 조건에 따라 달라질 수 있습니다. 숙주 배아에서 PGC를 해동하고 이식하기동결 보존된 PGC를 빠르게 해동하려면 바늘이 들어 있는 홀더를 바늘이 아래를 향하도록 하여 실온 1x EBR 용액에 밀어 넣고 10초 동안 담가 둡니다. 이식 유리 슬라이드를 s에 놓습니다.tag현미경의 s. 동결 해동된 바늘을 모세관 홀더에 부착하고 왼쪽 줄의 첫 번째 배아와 바늘 끝을 동일한 초점면으로 가져옵니다. 20x 대물 렌즈를 사용하여 바늘 끝을 배아의 뒤쪽 끝 표면으로 부드럽게 움직입니다. 각 배아의 바깥쪽을 부드럽게 찔러 천천히 원래 모양으로 돌아오도록 합니다. 찌르기는 배아의 내부 압력이 너무 높거나 낮지 않은지 확인할 것입니다. 바늘을 부드럽게 움직여 후극에서 배아를 관통합니다. 약 10-20개의 PGC를 후극 바로 안쪽, 정확하게 유리체 막과 배아의 체세포층 사이에 부드럽게 증착시킵니다. 체세포층에 침전시키지 마십시오. 배아에서 주위액이 새어 나오면 누출된 액체를 바늘 안으로 빨아들여 제거합니다. 배아에서 바늘을 빼냅니다. 후속 배아에 대해 3.2.5단계와 3.2.6단계를 반복합니다. 4. 배아 배양 및 기증자 균주 복원 이식된 PGC를 받지 않은 배아를 제거하고 나머지 배아를 25°C의 가습 챔버(그림 1G)에서 배양합니다. 이식 후 24시간 이상, 부화 후 가능한 한 빨리 겸자를 사용하여 부화한 유충을 집어 표준 초파리 먹이 바이알로 옮기고 25°C에서 배양합니다. 균주를 되살리려면 새로 출현한 암컷과 수컷을 교배해야 합니다(그림 6).참고: Agametic 숙주를 사용하면 균형기 염색체 균주를 교차하지 않고 전체 게놈을 한 번에 복원할 수 있습니다. 바이알에서 agametic 수컷의 공존은 암컷이 그들과 짝짓기를 하더라도 짝짓기에 대한 수용성 감소를 포함하여 장기적인 짝짓기 후 반응을 보이지 않기 때문에 중요하지 않습니다18,19.