Primordiale cryopreservatie van kiemcellen en heropleving van Drosophila-stammen

1. Voorbereiding van de apparatuur Micromanipulatorsysteem: Stel een micromanipulatorsysteem samen om cellen te verzamelen en te transplanteren (Figuur 1A). Glasplaatjes uit de PGC-collectie (Figuur 2A)Om heptaanlijm te bereiden, knipt u ongeveer 30 cm lange dubbelzijdige tape af en laat u deze een nacht weken in 7 ml technische (normale) heptaanoplossing. Teken twee parallelle referentielijnen voor de uitlijning van het embryo op de achterkant van een objectglaasje. Smeer druppels van bovenstaande heptaanlijm op het objectglaasje (aan de kant zonder de lijnen) met behulp van een pasteurpipet. Laat het oppervlak van de dia aan de lucht drogen totdat het wit wordt. Herhaal het toevoegen en verspreiden van heptaanlijmdruppels en droog het glaasje opnieuw.NOTITIE: De lijm voorkomt dat vloeibare oplossingen zich over het vlakke oppervlak verspreiden en maakt het gemakkelijker om waterige oplossingen in een naald te laden. Om frames voor embryobaden te maken, plakt u drie lagen standaard vinyltape van 0,2 mm dik, zoals isolatietape, op een snijplank. Knip de tape in rechthoeken van 1,5 cm breed. Knip vervolgens alle drie de lagen tape weg, zodat er een frame van 2 tot 3 mm overblijft.OPMERKING: Na het uitlijnen van embryo’s wordt een embryopoolframe aangebracht om een pool voor embryo’s te vormen. Transplantatie naaldenOPMERKING: Alle in de handel verkrijgbare naalden ten tijde van dit onderzoek waren te smal of te breed voor PGC-cryopreservatie.Maak een naald met behulp van een glazen capillair en een trekker. We gebruiken een NARISHIGE PN-31-trekker met het verwarmingsniveau op 85.0-98.4, het hoofdniveau van de magneet op 57.8 en het subniveau van de magneet op 45.0. Om een naald te maken met een wanddikte van ongeveer 1 μm en een punt van ongeveer 200 μm lang met een binnendiameter van 10-12 μm, polijst u de naaldpunt in het volgende proces in drie stappen (Figuur 3). Slijp eerst de naaldpunt onder een hoek van 30° met een snelheid van 780 tpm totdat de punt een binnendiameter heeft van 10-12 μm. Deze eerste maalstap duurt ongeveer 1 uur.NOTITIE: Om te voorkomen dat de naaldpunt breekt, draait u eerst de slijpsteen en beweegt u de naald vervolgens voorzichtig naar beneden op de slijpsteen. Teken een lijn op de bovenkant van de naald om de gewenste hoek te volgen. Draai de naald 90° tegen de klok in en polijst hem opnieuw met een snelheid van 180 tpm. Dit duurt ongeveer 5 min. Draai de naald 45° met de klok mee en polijst hem gedurende één seconde met een snelheid van 180 tpm. Plaats een verzamelglaasje met een druppel chroomzuurmengsel (LET OP: giftig) op de microscooptafel. Bevestig de naald aan de capillaire houder (Figuur 1D) in een hoek van 10°-13° ten opzichte van het schuifoppervlak, beweeg de naald voorzichtig naar beneden en dompel de punt onder in het chroomzuurmengsel. Door aan de zuiger te trekken en te duwen (Figuur 1B), laadt en laat u de oplossing meerdere keren mechanisch uit de naald lopen om glasresten in de naald te verwijderen. Zorg ervoor dat u ook de buitenmuur schoonmaakt. Was de binnen- en buitenkant van de naald twee keer met gedestilleerd water om het chroomzuur volledig te verwijderen. 2. Verzameling en cryopreservatie van PGC’s Embryo’s verzamelenBreng een passend aantal vliegen van de betreffende donorstam (ongeveer 450 voor elk geslacht voor de embryoverzamelbeker) over in een embryoverzamelbeker met een embryo-verzamelplaat (figuur 1E) en broed ze uit bij 25 °C. We gebruiken meestal oudervliegen van 3 tot 5 dagen oud die onder minder drukke omstandigheden bij kamertemperatuur (23-25 °C) worden gekweekt. Voer twee pre-collecties van 30 minuten uit en gooi alle gelegde eieren weg. Omdat vrouwtjes bevruchte eieren die zich in de eileider ontwikkelen kunnen behouden, is deze stap nodig om het leggen van eieren in stap 2.1.3 te synchroniseren (Figuur 4). Na de twee pre-collecties, verzamel embryo’s gedurende 50 minuten en incubeer de verzamelde embryo’s vervolgens in een bevochtigde kamer bij 25 °C om de embryo’s te laten ontwikkelen tot het blastodermstadium (vroeg stadium 517). De incubatietijd is gewoonlijk 100 min, maar kan worden verlengd tot 120 min, afhankelijk van de belasting (Figuur 4).NOTITIE: Een bevochtigde kamer wordt gemaakt door een vochtige papieren handdoek op de bodem van een plastic doos te plaatsen en deze voor gebruik met een waternevel te besproeien. In embryo’s in een vroeg stadium 5 is de PGC-vorming voltooid, maar somatische cellularisatie niet. Het exacte stadium van een embryo wordt in stap 2.4 onder een samengestelde microscoop bepaald. Dechorionerende embryo’sDeponeer een druppel gedestilleerd water op een roestvrijstalen zeef (150 maaswijdte, 109 μm opening, 60 μm draaddiameter; Figuur 1F). Verzamel met een tang embryo’s van de embryo-verzamelplaat en leg ze in de waterdruppel. Druk vloeipapier van onderaf tegen de zeef om het water op te nemen. Voeg druppeltjes verse 5% (als Cl) natriumhypochlorietoplossing toe aan de embryo’s en tik continu gedurende 10 s op de zeef. Was de embryo’s door ze direct met gedestilleerd water te bespatten en druk papieren zakdoekjes van onderaf tegen de zeef om het water op te nemen. Herhaal deze stap 3x. Uitlijnen van gedechorioneerde embryo’sGebruik onder een stereomicroscoop een pincet om embryo’s terug te plaatsen. Lijn de gedechorioneerde embryo’s in twee rijen uit op een PGC-objectglaasje langs de twee referentielijnen (Figuur 2A). De embryo’s zijn georiënteerd met hun voorkant naar rechts (de te manipuleren kant) en ventrale kant naar boven.OPMERKING: Deze stap moet in 20 minuten worden voltooid, waarbij we gewoonlijk ongeveer 40 embryo’s uitlijnen. Bevestig een embryopoolframe rond de embryo’s op het glasplaatje van de PGC-collectie. Breng 1 μL CPA-oplossing (1x Ephrussi-Beadle Ringer-oplossing, EBR, met 20% ethyleenglycol en 1 M sucrose; 1x EBR: 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2 en 10 mM Hepes bij pH 6,9) aan op twee afzonderlijke plaatsen in het gebied dat door het frame wordt omsloten en vul het zwembad met siliconenolie om uitdroging van de embryo’s te voorkomen (Figuur 2A).OPMERKING: Om de CPA-oplossing te bereiden, lost u 10,26 g sacharose volledig op in ongeveer 20 ml gedestilleerde H2O met 3 ml 10 x EBR-oplossing. Voeg 6 ml ethyleenglycol toe en voeg vervolgens gedistilleerd H2O tot 30 ml toe. Filtreer de oplossing na grondig mengen door een wegwerpmembraan van 0,22 mm. PGC’s verzamelenPlaats het objectglaasje uit de PGC-collectie van stap 2.3.2 op de tafel van een microscoop die is uitgerust met een micromanipulatorsysteem. Bevestig de naald aan de capillaire houder en breng het eerste embryo in de linkerrij en de naaldpunt in hetzelfde brandpuntsvlak. Laad siliconenolie in de naald gedurende 2-3 s. Begin met het verzamelen van PGC van embryo’s in de linkerrij. Gebruik een 20x objectieflens om de naaldpunt voorzichtig naar het oppervlak van het voorste uiteinde van het embryo te bewegen en het embryo naar het achterste uiteinde te penetreren, niet door de naald te bewegen, maar door de microscooptafel te verplaatsen. Wanneer de punt van de naald het achterste uiteinde bereikt, trekt u de naald iets terug en laat u de dooier in de naald net binnen de somatische cellaag volledig ontsnappen. Terwijl u de druk in de naald constant houdt, verplaatst u de naaldpunt naar de PGC’s net binnen de achterpool en laadt u de PGC’s voorzichtig, maar zonder veel tijd te kosten. Trek de naald snel uit het embryo en laat dooier en andere verontreinigingen uit de naald in het siliconenoliebad lopen, waarbij de PGC’s in de naald blijven. Laad vervolgens schone siliconenolie uit het zwembad. Herhaal stap 2.4.2 tot en met 2.4.5 voor de andere embryo’s in de linkerrij. Voordat u PGC’s van een nieuw embryo verzamelt, deponeert u zoveel mogelijk van de siliconenolie die in stap 2.4.5 is geladen in de somatische cellaag terwijl u geladen PGC’s in de naald houdt. Dit zorgt ervoor dat nieuw geladen PGC’s naast de eerder verzamelde PGC’s liggen zonder dat er tussenmateriaal tussen zit. Na het voltooien van de PGC-verzameling van embryo’s in de linkerrij, scheidt u PGC’s zoveel mogelijk van de dooier en andere verontreinigingen. Om dit te bereiken, deponeert u alle PGC’s in de naald op het oppervlak van een embryo en verwijdert u eventuele dooier of andere verontreinigingen naar een ander naburig embryo. Verzamel vervolgens PGC’s van embryo’s in de rechterrij. Combineer de PGC’s die zijn verzameld uit de rechter- en linkerrij. Cryoprotectief middel (CPA) toepassen op PGC’sNadat u de naald met CPA in één druppel hebt gewassen, laadt u verse CPA in een andere druppel in de naald en voegt u CPA toe aan de PGC’s die op het embryo zijn afgezet. Het volume van de CPA moet gelijk zijn aan dat van de PGC’s. Verwijder zoveel mogelijk CPA uit het cluster van PGC’s 1-2 s na de toevoeging van CPA. PGC’s krimpen iets en worden direct na CPA-toevoeging vierkant van vorm. Maak de naald leeg en laad vervolgens siliconenolie gedurende 5 s of langer. Laad alle verzamelde PGC’s en laad vervolgens opnieuw siliconenolie gedurende 5 s of langer. PGC’s zijn nu ingeklemd tussen twee lagen siliconenolie (Figuur 2B).NOTITIE: Het is belangrijk om zoveel mogelijk dooier, CPA en andere verontreinigingen te verwijderen. Cryopreservatie van PGC’sOpen de driewegkraan (Figuur 1C) en maak vervolgens de naald los van de micromanipulator. Dep de olie van het oppervlak van de naald met zacht tissuepapier. Raak de punt van de naald niet rechtstreeks aan met het weefsel. Bevestig de naald aan een naaldhouder en vergrendel deze op zijn plaats aan de basis met vinyltape (Figuur 1H). Plak een etiket op de houderbuis. Vries de houder met de naald naar beneden door hem onder te dompelen in vloeibare stikstof. Laat de houder pas los als de vloeistof niet meer uit het rek bruist. Bewaar de houder in een opslagtank voor vloeibare stikstof in het gebied van de vloeibare fase, niet in het gebied van de dampfase. 3. PGC’s ontdooien en verplanten Verzamelen, dechorioneren en uitlijnen van embryo’s van agametische gastheervliegenVerzamel en dechorioneer embryo’s van agametische gastheervliegen volgens stap 2. Lijn de stadium 5 agametische gastheerembryo’s uit op een glazen objectglaasje voor transplantatie. Oriënteer deze keer echter het achterste naar rechts (de te manipuleren kant) en ventrale naar boven (Figuur 5). Zet ongeveer 30 embryo’s in twee rijen op een rij in 20 minuten. Gebruik tijdens het uitlijnen van embryo’s een luchtbevochtiger gedurende 2-10 minuten als de luchtvochtigheid in de kamer dit vereist (tabel 1). De ideale luchtvochtigheid is 30% tot 40%, maar dit kan variëren afhankelijk van de thermische omstandigheden. Ontdooien en transplanteren van PGC’s in gastheerembryo’sOm gecryopreserveerde PGC’s snel te ontdooien, schuift u de houder met de naald in 1x EBR-oplossing op kamertemperatuur met de naald naar beneden gericht en houdt u deze 10 s ondergedompeld. Plaats het objectglaasje voor transplantatie op de tafel van een microscoop. Bevestig de gevriesdroogde naald aan de capillaire houder en breng het eerste embryo in de linkerrij en de naaldpunt in hetzelfde brandpuntsvlak. Gebruik een 20x objectieflens om de naaldpunt voorzichtig naar het oppervlak van het achterste uiteinde van het embryo te bewegen. Prik voorzichtig in de buitenkant van elk embryo en zorg ervoor dat ze langzaam terugkeren naar hun oorspronkelijke vorm. Het prikken zal bevestigen dat de inwendige druk van het embryo niet te hoog of te laag is. Beweeg de naald voorzichtig en penetreer een embryo vanaf de achterpool. Breng voorzichtig ongeveer 10-20 PGC’s aan net binnen de achterpool, precies tussen het vitellinemembraan en de somatische cellaag van het embryo. Vermijd het afzetten ervan in de somatische cellaag. Als de perivitellinevloeistof uit het embryo lekt, zuig dan de gelekte vloeistof in de naald en verwijder deze. Trek de naald terug uit het embryo. Herhaal stap 3.2.5 en 3.2.6 voor de volgende embryo’s. 4. Incubatie van embryo’s en herstel van donorstammen Verwijder alle embryo’s die geen getransplanteerde PGC’s krijgen en incubeer de resterende embryo’s in een bevochtigde kamer (figuur 1G) bij 25 °C. Gebruik 24 uur of langer na de transplantatie en zo snel mogelijk na het uitkomen een tang om de uitgekomen larven op te pakken en over te brengen naar standaard Drosophila-voedselflesjes en te incuberen bij 25 °C. Om de soort nieuw leven in te blazen, kruis je nieuw opgekomen vrouwtjes en mannetjes (Figuur 6).OPMERKING: Agametische gastheren maken het mogelijk om het hele genoom in één keer te herstellen zonder te kruisen met balancer-chromosoomstammen. Het naast elkaar bestaan van agametische mannetjes in een injectieflacon doet er niet toe, omdat vrouwtjes, zelfs als ze met hen gepaard zijn, geen langdurige reacties na de paring vertonen, waaronder verminderde ontvankelijkheid voor remating18,19.