果蝇菌株的原始生殖细胞冷冻保存和复兴

1.设备准备 显微操纵系统：组装显微操纵系统以收集和移植细胞（图1A）。 PGC收集载玻片（图2A）要制备庚烷胶，请剪下约 30 厘米长的双面胶带，并将其浸泡在 7 mL 工业（常规）级庚烷溶液中过夜。 在载玻片背面绘制两条平行的参考线，用于胚胎对齐。 使用巴斯德移液管将上述庚烷胶滴在载玻片上（在没有线条的一侧）。风干载玻片表面，直至变白。 重复庚烷胶滴的添加和扩散，并再次干燥载玻片。注意： 胶水可防止液体溶液在平面上扩散，并更容易将水溶液装入针头中。 要制作胚池框架，请在砧板上粘贴三层 0.2 毫米厚的标准乙烯基胶带，例如电工胶带。将胶带切成 1.5 厘米宽的矩形。然后，剪掉所有三层胶带，留下一个 2 到 3 毫米的框架。注意：在对齐胚胎后贴上胚池框架，以形成胚胎池。 移植针注意：在本研究时，所有市售针头对于 PGC 冷冻保存来说都太窄或太宽。使用玻璃毛细管和拉拔器制作针头。我们使用 NARISHIGE PN-31 拉拔器，加热器电平为 85.0-98.4，磁铁主电平为 57.8，磁铁子电平为 45.0。 要制造壁厚约为 1 μm 且尖端长度约为 200 μm、内径为 10-12 μm 的针头，请按照以下三步工艺抛光针尖（图 3）。首先，以 30 rpm 的速度以 780° 角向下研磨针尖，直到针尖的内径为 10-12 μm。第一个研磨步骤大约需要 1 小时。注意： 为避免折断针尖，请先旋转磨石，然后轻轻地将针向下移动到磨石上。 在针的顶部画一条线以跟踪所需的角度。将针头逆时针旋转 90°，然后以 180 rpm 的速度再次抛光。这大约需要 5 分钟。 将针头顺时针旋转 45°，然后以 180 rpm 的速度抛光一秒钟。 将装有一滴铬酸混合物（注意：有毒）的收集载玻片放在显微镜载物台上。将针头以相对于载玻片表面10°-13°的角度连接到毛细管支架（图1D），小心地向下移动针头，并将针头浸入铬酸混合物中。 通过拉动和推动柱塞（图1B），机械地将溶液从针头中加载和排出数次，以去除针头中的玻璃碎屑。一定要清洁外墙。 用蒸馏水清洗针头的内侧和外侧两次，以彻底去除铬酸。 2. PGCs的采集和冷冻保存 收集胚胎将适当数量的目标供体菌株的果蝇（胚胎收集杯的每个性别约450只）转移到带有胚胎收集板的胚胎收集杯中（图1E），并在25°C下孵育。 我们通常使用3至5日龄的亲蝇，这些苍蝇在室温（23-25°C）下在不那么拥挤的条件下饲养。 进行两次 30 分钟的预收集并丢弃任何产卵。由于雌性可以保留在输卵管中发育的受精卵，因此该步骤是步骤2.1.3中同步产卵所必需的（图4）。 在两次预收集后，收集胚胎50分钟，然后将收集的胚胎在25°C的加湿室中孵育，以使胚胎发育到胚层阶段（早期阶段5,17）。孵育时间通常为100分钟，但可以延长至120分钟，具体取决于菌株（图4）。注意： 加湿室是通过在塑料盒底部放置湿纸巾并在使用前喷洒水雾制成的。在早期 5 期胚胎中，PGC 形成完成，但体细胞化尚未完成。在步骤2.4中，在复合显微镜下确定胚胎的确切阶段。 胚胎去瘤将一滴蒸馏水沉积在不锈钢网过滤器（150目，109μm开口，60μm线径; 图1F）。使用镊子，从胚胎收集板中收集胚胎并将它们放入水滴中。 将纸巾从下方压在过滤器上以吸收水分。将新鲜的5%（Cl）次氯酸钠溶液滴入胚胎中，并连续敲击过滤器10秒。 直接用蒸馏水泼洒胚胎来清洗胚胎，然后从下面将纸巾压在过滤器上以吸收水分。重复此步骤 3 次。 对齐去皮胚胎在体视显微镜下，使用镊子移植胚胎。沿着两条参考线在PGC收集载玻片上将去角质的胚胎排成两排（图2A）。胚胎的方向是它们的前部向右（要操作的一侧），腹侧朝上。注意：此步骤应在 20 分钟内完成，在此期间我们通常对齐大约 40 个胚胎。 在PGC收集载玻片上的胚胎周围贴上胚池框架。将1μLCPA溶液（1xEphrussi-Beadle Ringer溶液，EBR，含有20%乙二醇和1M蔗糖;1x EBR：130mM NaCl，5mM KCl，2mM CaCl2和10mM Hepes，pH 6.9）滴在框架封闭区域的两个不同位置，并用硅油填充池以防止胚胎变干（图2A）。注：要制备 CPA 溶液，将 10.26 g 蔗糖完全溶解在含有 3 mL 10 x EBR 溶液的约 20 mL 蒸馏H 2O 中。加入 6 mL 乙二醇，然后加入蒸馏 H2O 至 30 mL。充分混合后，通过0.22毫米一次性膜过滤溶液。 收集 PGC将步骤2.3.2的PGC收集载玻片放在配备显微操纵器系统的显微镜的载物台上。将针头连接到毛细管支架上，并将左排中的第一个胚胎和针尖带入同一焦平面。将硅油放入针中 2-3 秒。 从左排的胚胎开始PGC收集。使用20倍物镜，轻轻地将针尖移动到胚胎前端的表面，然后将胚胎穿透到后端，不是通过移动针头，而是通过移动显微镜载物台。 当针尖到达后端时，稍微缩回针头，将针头中的任何蛋黄完全排出体细胞层内。 在保持针头压力恒定的同时，将针尖移动到后极内的 PGC，然后轻轻但不要花费太多时间加载 PGC。 快速将针头从胚胎中拉出，将针头中的蛋黄和其他污染物排入硅油池中，将PGC保持在针头中。然后，从池中装入干净的硅油。 对左行中的其他胚胎重复步骤2.4.2至2.4.5。在从新胚胎中收集PGC之前，将步骤2.4.5中加载的硅油尽可能多地沉积在体细胞层内，同时将加载的PGC保持在针中。这确保了新加载的 PGC 与先前收集的 PGC 相邻，它们之间没有任何干预材料。 从左排胚胎中完成PGC收集后，尽可能将PGC与蛋黄和其他污染物分离。为此，将针头中的所有PGC沉积到胚胎表面，并去除另一个相邻胚胎的任何蛋黄或其他污染物。 接下来，从右排的胚胎中收集PGC。合并从右行和左行收集的 PGC。 将冷冻保护剂 （CPA） 应用于 PGC用一滴 CPA 清洗针头后，将另一滴新鲜的 CPA 装入针头中，并将 CPA 添加到沉积在胚胎上的 PGC 中。CPA的数量应与PGC的数量相等。 添加 CPA 后，从 PGC 集群 1-2 秒中删除尽可能多的 CPA。添加 CPA 后，PGC 会略微收缩并立即变成方形。 清空针头，然后加入硅油 5 秒或更长时间。加载所有收集的 PGC，然后再次加载硅油 5 秒或更长时间。PGC现在夹在两层硅油之间（图2B）。注意： 尽可能多地去除蛋黄、CPA 和其他污染物很重要。 低温保存 PGC打开三通旋塞阀（图1C），然后将针头从显微操纵器上拆下。用软纸巾吸干针头表面的油。不要直接用纸巾接触针尖。 将针头连接到针架上，并使用乙烯基胶带将其锁定在底座上（图1H）。在支架管上贴上标签。 将针头朝下，将其浸入液氮中，快速冷冻支架。在液体停止从架子中嘶嘶作响之前，不要松开支架。 将支架存放在液相区域的液氮储罐中，而不是气相区域。 3. PGCs的解冻和移植 从非配子宿主果蝇中收集、去皮和比对胚胎按照步骤2从非配子宿主果蝇中收集和去胚胎去皮。 将第5阶段的非配子宿主胚胎对齐在移植载玻片上。然而，这一次，将后部定向右侧（要操纵的一侧），腹侧定向顶部（图5）。在20分钟内将大约30个胚胎排成两排。 在对齐胚胎时，如果室内湿度需要，请操作加湿器2-10分钟（表1）。理想的湿度为 30% 至 40%，但这可能因热条件而异。 在宿主胚胎中解冻和移植PGC要快速解冻冷冻保存的PGC，将装有针头的支架滑入室温1x EBR溶液中，针头朝下，并保持浸没10秒。 将移植载玻片放在显微镜的载物台上。将冻融的针头连接到毛细管支架上，并将左排中的第一个胚胎和针尖带入同一焦平面。 使用20倍物镜，轻轻地将针尖移动到胚胎后端的表面。 轻轻地戳每个胚胎的外部，确保它们慢慢恢复到原来的形状。刺激将确认胚胎的内部压力不会太高或太低。 轻轻移动针头，从后极穿透胚胎。 轻轻地将大约 10-20 个 PGC 沉积在后极内，正好在卵黄膜和胚胎的体细胞层之间。避免将它们沉积在体细胞层中。如果卵黄周围液从胚胎中渗出，将渗漏的液体吸入针头并将其取出。 将针头从胚胎中缩回。对后续胚胎重复步骤3.2.5和3.2.6。 4. 孵化胚胎和恢复供体菌株 去除任何未接受移植PGC的胚胎，并将剩余的胚胎在25°C的加湿室（图1G）中孵育。 在移植后24小时或更长时间以及孵化后尽快，使用镊子将孵化的幼虫捡起并转移到标准 果蝇 食品瓶中，并在25°C下孵育。 为了恢复该菌株，将新出现的雌性和雄性杂交（图6）。注意：无配子宿主可以一次恢复整个基因组，而无需与平衡染色体菌株杂交。非配子雄性在小瓶中的共存无关紧要，因为雌性即使与它们交配，也不会表现出长期的交配后反应，包括对重新分配的接受度降低18,19。