In-vivo Кальциевая визуализация сенсорных нейронов тройничного ганглия крысы

Соматоощущение, нейронное кодирование механических, тепловых и химических раздражителей, воздействующих на кожу или другие структуры организма, включая мышцы, кости и внутренние органы, начинается с активности первичных афферентных нейронов, которые иннервируют^{эти структуры}. Электрофизиологические подходы, основанные на единичных единицах, предоставили огромное количество информации о афферентных подтипах, участвующих в этом процессе, а также о том, как их свойства стимул-реакция могут изменяться с течением времени ^1,2,3. Тем не менее, несмотря на то, что остаются убедительные доказательства в поддержку теории меченых линий, которая предполагает, что специфические сенсорные модальности передаются определенными субпопуляциями нейронов, способность многих субпопуляций нейронов реагировать на одни и те же типы механических, тепловых и химических стимулов предполагает, что большинство соматосенсорных стимулов кодируются несколькими субпопуляциями нейронов^{. 5}. См. Таким образом, лучшее понимание соматочувствительности придет только при условии одновременного изучения активности 10, если не сотен, нейронов.

Прогресс в оптических подходах с относительно недавним появлением конфокальных и, впоследствии, многофотонных и цифровых методов визуализации облегчил возможность проведения относительно неинвазивного анализа активности нейронов на популяционном уровне ^6,7. Одним из последних препятствий в применении этой технологии стала разработка инструментов, позволяющих проводить оптическую оценку нейронной активности. Учитывая скорость потенциала действия, которая может начинаться и заканчиваться менее чем за миллисекунду, чувствительный к напряжению краситель, способный следовать за изменениями мембранного потенциала со скоростью потенциала действия, был бы идеальным инструментом для этой цели. Но, несмотря на то, что в этой области был достигнут огромный прогресс⁽7,8,9,10), отношение сигнал/шум для многих из этих красителей все еще недостаточно велико, чтобы можно было провести популяционный анализ сотен нейронов на уровне отдельных клеток. В качестве альтернативного подхода исследователи обратились к мониторингу изменений внутриклеточной концентрации Ca²⁺ ([Ca²⁺]_i). Ограничения этой стратегии были очевидны с самого начала и включают в себя тот факт, что увеличение [^Ca2+]_i является косвенной мерой нейронной активности¹¹; что увеличение [^Ca2+]_i может происходить независимо от притока^Ca2+, связанного с активацией потенциал-зависимых каналов^Ca2+ (VGCC)^12,13; что величина и продолжительность переходного процесса Ca2⁺ могут контролироваться процессами, независимыми от активности VGCC 11,12,14; и что временной ход переходных процессов Ca²⁺ намного превышает ход потенциала действия¹⁵. Тем не менее, существует ряд существенных преимуществ, связанных с использованием Ca2⁺ в качестве косвенного показателя нейронной активности. Не последнее место среди них занимает отношение сигнал/шум, связанное с большинством индикаторов Ca2⁺, отражающее как величину изменения внутриклеточного^Ca2+, так и тот факт, что сигнал возникает из трехмерного пространства цитозоля, а не из двумерного пространства клеточной мембраны. Кроме того, с разработкой генетически кодируемых индикаторов Ca²⁺ (GECI) стало возможным использовать преимущества генетических стратегий для стимулирования экспрессии индикаторов Ca²⁺ в конкретных субпопуляциях клеток, облегчая анализ на популяционном уровне интактных препаратов (см., например,¹⁶).

Учитывая количество генетических инструментов, доступных в настоящее время у мышей, неудивительно, что GECI наиболее широко использовались у этого вида. Разработаны линии мышей с конститутивной экспрессией GECI в субпопуляциях сенсорных нейронов ^7,16,17. С развитием мышиных линий, экспрессирующих рекомбиназы в определенных типах клеток, стало возможным использовать еще более сложные стратегии для контроля экспрессии GECI¹⁵. Однако, несмотря на то, что эти инструменты становятся все более мощными, существует ряд причин, по которым другие виды, такие как крысы, могут быть более подходящими для некоторых экспериментальных вопросов. К ним относятся больший размер, облегчающий ряд экспериментальных манипуляций, которые трудны, если не невозможны, на меньшей мыши; легкость обучения крыс относительно сложным поведенческим задачам; и, по крайней мере, некоторые доказательства того, что биофизические свойства и паттерны экспрессии нескольких ионных каналов в сенсорных нейронах крыс могут быть более похожи на те, которые наблюдаются в сенсорных нейронах человека, чем те же каналы у мышей по сравнению^{с человеческими}.

В то время как трансдукция соматосенсорных стимулов обычно происходит в периферических терминалях первичных афферентов, потенциал действия, инициированный на периферии, должен пройти через структуру, в которой находятся первичные афферентные соматы, называемые дорсальными корешками (DRG) или тройничным (TG) ганглиями, прежде чем достичь центральной^{нервной системы}. Хотя имеются доказательства того, что не каждый потенциал действия, распространяющийся вдоль первичного афферентного аксона, вторгается в тело клетки²⁰, вследствие того факта, что первичные афферентные соматы соединены с главным афферентным аксоном через Т-соединение¹⁹, большинство потенциалов действия, инициированных на периферии, по-видимому, вторгаются в сому²¹. Это дает три экспериментальных преимущества при использовании GECI для оценки популяционного кодирования в первичных афферентах: большой размер тела клетки по отношению к аксонам еще больше увеличивает сигнал/шум при использовании [Ca²⁺]_i в качестве косвенной меры афферентной активности; DRG, как правило, легко доступны; А оценка активности в участке, который пространственно удален от афферентных окончаний, сводит к минимуму потенциальное влияние операции, необходимой для обнажения ганглиесов, на свойства стимул-реакция афферентных окончаний. Однако, поскольку ТГ расположены под мозгом (или над палитрой), к ним гораздо труднее получить доступ, чем к DRG. Кроме того, несмотря на то, что между нейронами DRG и TG есть много общего, список различий также растет. Это включает в себя грубо соматотопическую организацию нейронов в TG²², уникальные иннервированные структуры, различные паттерны окончания центральных концов 23,24,25,26, а теперь и растущий список различий как в экспрессии генов^27,28, так и в экспрессии функциональных рецепторов²⁹. Кроме того, поскольку мы заинтересованы в идентификации периферических механизмов боли, относительно большое количество болевых синдромов, которые, по-видимому, являются уникальными для тройничной системы (например, мигрень, невралгия тройничного нерва, синдром жжения во рту), которые, по-видимому, включают аберрантную активность в первичных афферентах 30,31,32, позволяет предположить, что ТГ необходимо изучать напрямую.

Таким образом, несмотря на то, что свойства ТГ-нейронов типа «стимул-реакция» были изучены с помощью ГЭСИ у мыши¹⁶, поскольку перечисленные выше причины позволяют предположить, что крыса может быть более подходящим видом для решения различных экспериментальных вопросов, целью настоящего исследования была разработка подхода к использованию ГЭСИ для изучения нейронов ТГ у крысы. Для достижения этой цели мы использовали вирусный подход, чтобы стимулировать экспрессию GECI GCaMP6 в периферической нервной системе. Затем мы удалили передний мозг, чтобы обеспечить доступ к ТГ. Наконец, механические и тепловые стимулы были приложены к лицу, в то время как нейронные реакции оценивались под флуоресцентной микроскопией. В совокупности эти данные подтверждают роль крысы в исследовании изменений в ТГ при многих состояниях, расширяя инструментарий для исследователей, заинтересованных в сенсорном кодировании в тройничном нерве.