生体内 ラット三叉神経節における感覚ニューロンのカルシウムイメージング

身体感覚は、皮膚や筋肉、骨、内臓などの身体構造に影響を与える機械的、熱的、化学的刺激の神経コードであり、^{これらの構造を}神経支配する一次求心性ニューロンの活動から始まります1。単一ユニットベースの電気生理学的アプローチは、このプロセスに関与する求心性サブタイプと、それらの刺激応答特性が時間の経過とともにどのように変化するかについての豊富な情報を提供しています^1,2,3。しかし、特定の感覚モダリティがニューロンの特定のサブポピュレーションによって伝達されることを示唆する標識線理論を支持する強力な証拠が残っている一方で、ニューロンの多くのサブポピュレーションが同じタイプの機械的、熱的、および化学的刺激に応答する能力は、体性感覚刺激の大部分がニューロンの複数のサブポピュレーションによってコードされていることを示唆しています^4。5.したがって、体性感覚をよりよく理解するには、数百とは言わないまでも、数十のニューロンの活動を同時に研究する能力が必要です。

比較的最近の共焦点およびそれに続く多光子およびデジタルイメージング技術の出現による光学的アプローチの進歩により、ニューロン活動の比較的非侵襲的な集団レベルの分析を実行する能力が容易になりました^6,7。この技術の応用における最後のハードルの1つは、神経活動の光学的評価を可能にするツールの開発でした。活動電位の速度がミリ秒未満で開始および終了することを考えると、活動電位の速度で膜電位の変化に追従する能力を備えた電位感受性色素は、この目的に理想的なツールです。しかし、この分野では驚異的な進歩がありました^{が7、8、9、10}、これらの色素の多くは、単一細胞レベルで数百のニューロンの集団分析を可能にするには、まだ十分に高くありません。代替アプローチとして、研究者は細胞内^Ca2+濃度([^Ca2+]_i)の変化をモニタリングすることに目を向けました。この戦略の限界は当初から明らかであり、[Ca²⁺]_iの増加が神経活動の間接的な尺度であるという事実を含む¹¹。[^Ca2+]_iの増加は、電位依存性^Ca2+チャネル(VGCC)の活性化に関連する^Ca2+流入とは無関係に起こり得ること^12,13;^Ca2+トランジェントの大きさと持続時間は、VGCC活性とは無関係なプロセスによって制御され得ること11,12,14;そして、^Ca2+トランジェントの時間経過は、活動電位の時間経過^{をはるかに超えています15}。それにもかかわらず、神経活動の間接的な尺度としての^Ca2+の使用に関連する多くの重要な利点があります。これらのうち、ほとんどの^Ca2+指標に関連するS/N比は、細胞内^Ca2+の変化の大きさと、シグナルが細胞膜の2次元空間ではなく細胞質の3次元空間から生じているという事実の両方を反映しています。さらに、遺伝的にコードされたCa²⁺指標(GECI)の開発により、細胞の特定の亜集団におけるCa²⁺指標の発現を促進する遺伝的戦略を利用することが可能になり、インタクト調製物における集団レベルの分析が容易になります(例えば、¹⁶を参照のこと)。

現在マウスで利用可能な遺伝的ツールの数を考えると、GECIがこの種の中で最も広く使用されていることは驚くことではありません。感覚ニューロンの亜集団における構成的GECI発現を有するマウス系統が開発されている^7,16,17。特定の細胞型でリコンビナーゼを発現するマウス系統の開発により、GECI発現を制御するためにさらに高度な戦略を使用することが可能になった¹⁵。しかし、これらのツールはかつてないほど強力になっていますが、ラットなどの他の種が実験的な問題に適している理由はいくつかあります。これらには、サイズが大きいことが含まれ、小さなマウスでは不可能ではないにしても困難な多くの実験的操作を容易にします。比較的複雑な行動課題におけるラットの訓練の容易さ。そして、ラットの感覚ニューロンにおけるいくつかのイオンチャネルの生物物理学的特性および発現パターンは、ヒトと比較したマウスの同じチャネルよりもヒトの感覚ニューロンで観察されたものとより類似している可能性があるという少なくともいくつかの証拠¹⁸。

体性感覚刺激の伝達は一般に一次求心性神経の末梢末端で起こるが、末梢で開始された活動電位は、中枢神経系に到達する前に、後根(DRG)または三叉神経節(TG)神経節と呼ばれる一次求心性体細胞を収容する構造を通過しなければならない¹⁹。一次求心性軸索に沿って伝播するすべての活動電位が細胞体に侵入するわけではないという証拠があるが²⁰、一次求心性体細胞がT結合を介して主求心性軸索に結合しているという事実の結果として¹⁹、末梢で開始された活動電位の大部分は体細胞²¹に侵入するように見える.これは、GECIを使用して一次求心性における集団コーディングを評価する際に、3つの実験的利点をもたらします:軸索に対する細胞体のサイズが大きいため、[Ca²⁺]_iを求心性活動の間接的な尺度として使用する場合、信号対雑音比がさらに増加します。DRGは一般的に簡単にアクセスできます。また、求心性終末から空間的に離れた部位での活動を評価することで、求心性終末の刺激反応特性に対する神経節を露出させるために必要な手術の潜在的な影響を最小限に抑えることができます。ただし、TGは脳の下(またはパレットの上)にあるため、DRGよりもはるかにアクセスが困難です。さらに、DRGニューロンとTGニューロンの間には多くの類似点がありますが、相違点のリストも増えています。これには、TGにおけるニューロンのほぼ体性構成²²、神経支配されたユニークな構造、異なる中枢末端終末パターン^{23、24、25、26}、そして現在では遺伝子発現^27,28と機能的受容体発現の両方における相違点のリストが拡大している²⁹が含まれる.さらに、疼痛の末梢メカニズムの同定に関心があるため、三叉神経系に特有と思われる疼痛症候群(片頭痛、三叉神経痛、口内灼熱症候群など)が比較的多数あり、一次求心性に異常な活動性が関与しているように見える30,31,32は、TGを直接研究する必要があることを示唆しています。

このように、TGニューロンの刺激応答特性は、マウス¹⁶のGECIを用いて研究されてきたが、上記の理由により、ラットは様々な実験的問題に取り組むのにより適切な種である可能性が示唆されるため、本研究の目的は、ラットのTGニューロンを研究するためにGECIを使用するアプローチを開発することであった。これを達成するために、末梢神経系におけるGECI GCaMP6の発現を促進するウイルスアプローチを利用しました。次に、前脳を切除してTGにアクセスできるようにしました。最後に、機械的刺激と熱的刺激を顔面に当て、神経細胞の反応を蛍光顕微鏡で評価しました。これらのデータを総合すると、ラットを利用して多くの状態下でTGの変化を調査する役割が支持され、三叉神経系の感覚コーディングに関心のある研究者のためのツールキットが拡大されます。